UPLC－MS/MS同时测定蔬菜中阿维菌素等5种常用农药残留量

易锡斌，梁玉树，黄晓琴，孙慧珍，江 楚，刘世琦*

(1．山东农业大学 园艺科学与工程学院，山东 泰安 271018;2．新希望集团，四川 成都 610023;3．山东农业大学化学材料与工程学院，山东 泰安 271018;4．新希望六和股份有限公司，山东 青岛 266555)

甲氨基阿维菌素苯甲酸盐(Emamectin benzoate，简称甲维盐)属大环内酯类抗生素中的阿维菌素类生物农药(Avermectins，AVMs)，主要成分为阿维菌素B1α(占90%以上)、阿维菌素B1β，甲维盐B1α(占90%以上)、甲维盐B1β，因此常以阿维菌素B1α和甲维盐B1α为主要研究对象。阿维菌素类农药具有很高的杀虫活性，而甲维盐作为一种新型高效的半合成生物源杀虫剂，其药效高于阿维菌素，是农作物中广泛使用的杀虫剂。甲维盐对蜜蜂、鹤鹑、家蚕、斑马鱼具有高毒性，目前，欧盟规定其在稻米中的残留限量为0.01 mg/kg，国际食品法典委员会(CAC)规定其在在棉籽中的残留限量为0.02 mg/kg，我国则规定甲氨基阿维菌素在黄瓜、番茄中的残留限量为0.02 mg/kg，在马铃薯、西葫芦中的残留限量为0.01 mg/kg［1］。吡虫啉作为低毒杀虫剂或杀菌剂常用于水果和蔬菜等农作物的病虫害防治。日本“肯定列表”规定其在番茄中的残留限量为2 mg/kg，CAC和欧盟的限量均为0.5 mg/kg，我国的限量标准规定其在黄瓜、番茄中的残留限量为1 mg/kg，大白菜中的最低限量为0.2 mg/kg。茚虫威是美国杜邦公司近年来开发生产的一种低毒杀虫剂，常用于防治甘蓝、花椰类、芥蓝、番茄、辣椒、黄瓜等作物的虫害。我国规定其在甘蓝、菠菜的残留限量3 mg/kg，芥蓝、白菜的残留限量为2 mg/kg。代森锌在农业上常用来防治蔬菜、瓜果等的霜霉病、炭疽病、晚疫病、白腐病、黑斑病、黑星病等，属于广谱性、低毒类杀菌剂。尽管世界各国对其致癌机制和致畸性尚处于研究和争议之中，但其使用广泛、用量较大，毒性积蓄不可忽视。目前已有很多国家对食品中代森类农药规定了最高残留限量，其中日本“肯定列表”制度(以二硫代氨基甲酸酯计)规定了196种农产品中二硫代氨基甲酸酯的最高残留限量;美国规定了74种农产品中代森锰锌的最高残留限量;澳大利亚规定了61种农产品中(以二硫代氨基甲酸酯计)代森锌的最高残留限量;我国规定此类农药在芦笋、番茄、黄瓜等农产品中的最高残留限量为1～5 mg/kg，花生仁中的最低限量为0.1 mg/kg。

阿维菌素类农药残留的检测方法有液相色谱－紫外法，但该类方法的灵敏度低;也有采用液相色谱－串联质谱法［2－7］的报道，但是方法具有专属性。吡虫啉、茚虫威常用液相色谱－紫外法进行检测，目前已建立该两种化合物在茶叶、蔬菜水果等农产品中残留的液相色谱－串联质谱的检测方法［8－13］，但前处理操作复杂。代森锌的检测一直用衍生法，国家标准方法通过在酸性条件下用SnCl2还原，将其衍生成CS2后，用GC－ECD或FPD进行检测，其前处理操作复杂，并且存在干扰。近年来，LCMS/MS方法也有报道，但该方法无论衍生后检测还是直接检测［16］均存在检测成本高、效率低的问题。随着人们对合用药残毒性关注度的不断提高［17－18］，多残留检测日渐受到重视，同时检测某一类药物残留量的方法也有较多报道，但未见同时检测阿维菌素、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、吡虫啉、茚虫威及代森锌5种农药的报道。本文开发了同时检测蔬菜中上述5种常用农药的前处理方法，通过优化仪器参数，建立了正、负离子同扫模式的UPLC－MS/MS方法。方法成本低、速度快、灵敏度高，可为研究阿维菌素等农药在蔬菜中的残留代谢规律、蔬菜的质量安全控制与监测提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Triple Quad 4500液相色谱－三重四极杆串联质谱联用仪，配电喷雾离子源(美国AB SCIEX公司)，AB－135型电子分析天平(梅特勒托利多上海有限公司);LD5－2B离心机(北京京立离心机有限公司);KQ－500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);DF－18组织匀浆机(山东农业大学茶学系);RV100旋转蒸发仪、旋涡混匀器MS3(德国IKA公司)。

乙腈、甲醇(色谱纯，默克公司);甲酸、乙酸铵、氨水(分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司);氢氧化钠、氯化钠、无水硫酸钠、EDTA－Na2(分析纯，国药集团化学试剂有限公司);L-半胱氨酸(99%，阿拉丁试剂上海有限公司);阿维菌素、甲维盐、吡虫啉、茚虫威、代森锌(含量95%～99.5%，Sigma公司)。净化材料:C18固相萃取小柱、石墨化碳小柱、弗罗里硅土小柱、中性氧化铝小柱及其填料由天津博纳艾杰尔科技有限公司和美国菲罗门公司(Phenomenex)提供。

豆角、辣椒、青菜、黄瓜、芦笋、蕃茄样品由山东农业大学实验基地提供。

溶剂A:0.1%氢氧化钠溶液。溶剂B:含10 mmol/L EDTA－Na2和10 mmol/L L-半胱氨酸的乙腈水溶液，称取0.605 8 g L-半胱氨酸，1.861 2 g EDTA－Na2，用约50 mL水溶解后，加乙腈至500 mL。

标准物质储备溶液:准确称取适量的阿维菌素、甲维盐、吡虫啉、茚虫威标准品，用甲醇配成质量浓度为100.0 mg/L的标准溶液;代森锌标准品中加入2 mL溶剂A溶解后，加入溶剂B配制成1 000.0 mg/L的标准溶液，于4℃避光保存。

标准物质使用液:准确移取适量标准溶液，分别稀释成阿维菌素、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、吡虫啉及茚虫威的质量浓度为5，10，25，50，100，200 μg/L;代森锌的质量浓度为50，100，250，500，1 000，2 000 μg/L，现配现用。

1.2 样品处理

1.2.1 提取采集代表性样品200 g，用食品加工机粉碎成粒径不超过3 mm的精制样。称取5.00 g精制样品于50 mL具塞离心管中，加入5.00 mL溶剂A，用组织匀浆机以11 000 r/min转速匀浆30 s后，再加入15.00 mL溶剂B，加塞密封，于旋涡混匀器混合30 s后，置超声波清洗器中于20℃ 超声提取15 min，以4 800 r/min离心5 min，取上清液待净化。

1.2.2 净化取提取液5 mL置于15 mL离心管中，加入0.2 g C18+0.05 g GCB，混匀涡旋1 min，5 000 r/min离心5 min后，取上清液1 mL，过0.22 μm滤膜。取5 μL滤液进行UPLC－MS/MS分析。

1.3 色谱与质谱条件

1.3.1 色谱条件 色谱柱:Hypersil BDS C18(100 mm×4.6 mm×5 μm);流动相A:10 mmol/L氨水，流动相B:100%乙腈;流速0.3 mL/min。梯度洗脱程序:0～0.5 min，20%B;0.5～1.5 min，20%～90%B;1.5～5.0 min，90%B;5.0～5.5 min，90%～20%B;5.5～6.5 min，保持20%B。

1.3.2 质谱条件 ESI正、负离子同扫模式，多反应监测(MRM)参数:气帘气40.0 psi，正离子化电压4 500 V，负离子化电压－5 500 V，离子源温度250℃，电喷雾气50 psi，辅助加热气55 psi，碰撞气8 psi，驻留时间50 ms。优化后的母离子Q1、子离子Q3、去簇电压(Declustering potential)、碰撞能(Collision energy)、出口电压(Collision cell exit potential)见表1。入口电压10 eV，0.5～5.0 min采用阀切换入质谱，其余切换入废液，0～1.5 min采集MRM负离子，1.5～6.5 min采集MRM正离子。

表1 MRM监测模式下5种农药的仪器优化参数Table 1 Optimized parameters of multi－reaction monitoring for analysis of five pesticides

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择

阿维菌素、甲维盐、吡虫啉、茚虫威一般均选择甲醇或乙腈提取，但代森锌属于乙撑双二硫代氨基甲酸盐类农药，不溶于乙腈、甲醇等提取剂，需在碱性条件下转化为水溶性的盐类，用EDTA－Na2络合Zn2+，在还原剂L-半胱氨酸保护下，以甲醇水或乙腈水提取［16，19］。实验比较了氨水、氢氧化钠溶液对5种农药的提取效果，结果表明，使用氨水时代森锌无法转化为可溶性盐，回收率为0;分别采用0.05%，0.1%，1%的氢氧化钠预处理后进行提取，5种药物的回收率均在70%以上，虽然氢氧化钠溶液在短时间内对药物测定无明显影响，但过高浓度的氢氧化钠进入提取液时，将形成离子抑制效应，影响质谱检测，从而导致代森锌响应低或无响应。因此，最终确定采用0.1%的氢氧化钠溶液。用含EDTA－Na2(10 mmol/L)和L-半胱氨酸(10 mmol/L)的乙腈水溶液配制混标溶液以考察标准溶液的稳定性，结果显示，48 h内浓度无明显变化。故实验选择0.1%的氢氧化钠溶液溶解和稀释样品，再采用含EDTA－Na2(10 mmol/L)和L-半胱氨酸(10 mmol/L)的乙腈水溶液进行提取。

2.2 净化方法的选择

蔬菜样品提取液一般色泽较深，而且含有较多的有机质，常用弗罗里硅土、石墨化碳(GCB)、乙二胺－N-丙基甲硅烷(PSA)、C18作净化柱。比较了弗罗里硅土、GCB、PSA、C18小柱等净化方式对目标分析物的影响，结果显示，GCB的去色素效果最好，但代森锌、阿维菌素无回收，其他柱对青菜、辣椒等的色素几乎无净化效果，且优化洗脱条件也不能使5种药物的回收率同时达到70%以上。采用固相萃取小柱净化虽然便于实现自动化操作，但实验操作严格、费时，而且回收率不稳定，由于5种农药的极性相差大，难以找到合适极性的洗脱溶剂和洗脱体积，因此选择基质分散固相萃取法。最终试验显示，每5 mL提取液采用0.2 g C18+0.05 g GCB进行基质分散固相萃取时，净化效果和回收率符合检测要求，故选取0.2 g C18+0.05 g GCB以基质分散固相萃取方式进行净化。除辣椒、青菜的提取液略呈黄色，其他4种蔬菜的提取液均为无色。对净化前后6种基质溶液进行光谱扫描，结果显示，净化后，溶液的近紫外光谱区至可见光谱区的吸收值下降并趋于平滑，说明净化效果良好。

2.3 质谱条件的优化

在负离子模式下，对代森锌进行母离子Q1扫描，代森锌形成［M－Zn－H］－(m/z 210.8)，其他4种药物采用正离子模式进行母离子Q1扫描，结果发现，阿维菌素的响应受离子源温度的影响极大，在通常设定的温度550℃条件，根本无法找到母离子，而且在未加入NH+4时形成的分子离子峰强度极弱，只扫描到极低丰度的加Na+峰，加入NH+4后［M+NH4］+(m/z 890.7)的强度大于 ［M+Na］+，几乎无［M+H］+峰。甲维盐在水溶液状态下，电离出甲氨基阿维菌素(C49H75NO13)和苯甲酸盐(C7H6NO2)，扫描到［M－C7H6O2+H］+(m/z 886.8)。吡虫啉和茚虫威的母离子均以［M+H］+形式存在，其质荷比分别为m/z 256.3，m/z 528.1。确定母离子后，再对母离子进行子离子扫描，从而确定子离子和碰撞能量。考察了离子源温度(150，200，250，300，350，550℃)对5种药物响应值的影响，结果显示，阿维菌素的响应值随温度的上升而降低，其他药物的响应值随离子源温度的上升而增强，阿维菌素响应值对离子源温度变化曲线与代森锌响应值对温度曲线在200℃处相交(图1)，结果显示，200℃为最佳温度，但考虑到同时检测5种药物应结合标准限量要求，因此最终确定离子源温度为250℃。同时对质谱的毛细管电压、锥孔电压、脱溶剂气和锥孔气进行了优化。优化后的质谱参数列于表1。为了最大限度去除水溶性杂质及有机质干扰，根据各分析目标物的相对保留时间对进入质谱前的流动相进行了阀切换，0.5～5.0 min切换入质谱，其余切换入废液，0～1.5 min采集MRM负离子，1.5～6.5 min采集MRM正离子。选取离子丰度较强3个母子离子对，在MRM条件下，5种农药的总离子流图及选择离子流图见图2。

图1 5种农药在不同离子源温度条件下的响应值曲线图Fig.1 Response values of five pesticides at different ion source temperature conditions

图2 5种农药在多反应监测(MRM)模式下的总离子流图(TIC)及选择离子流谱图Fig.2 Total and daughter ion current chromatograms of five pesticides solution under multiple reaction monitoring mode concentration of abamectin，emamectin benzoate，imidacloprid and indoxacarb:10 μg/L;concentration of zineb:100 μg/L

2.4 色谱柱与流动相的选择

分别用C4、C18柱、阳离子交换柱、氨基柱进行实验，发现5种药物均能获得良好分离，但阿维菌素在C4、阳离子交换柱、氨基柱上的保留时间长，且部分药物峰形不对称。而Hypersil BDS C18硅胶担体键合前经过专门的碱钝化处理，极大地降低了残余硅羟基与分析物之间的相互作用，从而改善了色谱峰形。

常用的流动相体系有:0.1%甲酸水－甲醇、0.1%甲酸水－乙腈、0.1%氨水－甲醇等，为了改善分离度，通常在流动相中添加乙酸铵或甲酸铵。本实验发现，虽然在流动相中加入甲酸能有效消除峰形拖尾现象，大幅提高响应值［2］，但代森锌无响应。参照文献 ［18］，采用10 mmol/L氨水－乙腈体系，5种化合物均有较好的响应。优化实验条件下5种化合物的分离图见图2。

2.5 线性范围、检出限及定量下限

配制与待测样品相同基质的混合标准系列工作液，其中阿维菌素、甲维盐、吡虫啉、茚虫威的浓度梯度为5，10，25，50，100，200 μg/L，代森锌的浓度梯度为50，100，250，500，1 000，2 000 μg/L，以选定的定量离子峰面积(y)对相应质量浓度(x，μg/L)作标准曲线，线性方程及相关系数列于表2。向空白样品中添加目标化合物，按“1.2”方法进行处理后上机分析，以3倍信噪比确定检出限，以10倍信噪比确定定量下限，并采用低、中、高3个加标水平将标准品溶液加入空白样品中，按照“1.2”方法进行处理后上机分析进行回收率实验，结果列于表2。结果显示，在不同基质中，代森锌的线性范围为50～2 000 μg/L，其余4种农药的线性范围为5～200 μg/L，相关系数(r2)为0.995 1～0.999 9，表明方法的线性相关性良好;在所试验的基质中，虽然代森锌的检出限较高，但能满足限量标准要求，其他药物的检出限均低于1 μg/kg，定量下限在10 μg/kg以内，均满足国外农药残留限量标准以及我国农药残留限量标准GB 2763－2014标准限量［1］要求。回收率不低于70.8%，RSD均不高于13.9%，符合国内外法规对农药残留检测方法的质量控制要求。

2.6 实际样品的测定

应用本方法对周边市场所购买的豆角、辣椒、青菜、黄瓜、芦笋、蕃茄等36个蔬菜样品进行检测，其中吡虫啉的检出比例为5%，含量为1.5～16.4 μg/kg，主要存在于豆角样品。黄瓜样品中检出的阿维菌素均低于定量下限。其它样品未检出此5种农药残留。

表2 5种农药的线性方程、相关系数、检出限、定量下限及加标回收率Table 2 Linear equations，correlation coefficients(r2)，limits of detection(LODs)，limits of quantitation(LOQs)and spiked recoveries of five pesticides

3 结论

本文建立了UPLC－MS/MS同时检测蔬菜中阿维菌素、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐(甲维盐)、吡虫啉、茚虫威、代森锌的分析方法。研究表明，5种农药的加标回收率为70.8%～103.6%，相对标准偏差(n=5)为4.5%～13.9%，阿维菌素、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、吡虫啉、茚虫威在5种蔬菜中的检出限为0.02～0.7 μg/kg，定量下限为0.07～2.3 μg/kg，代森锌的检出限为8.2～30 μg/kg，定量下限为27～100 μg/kg。方法快捷、操作简单、环保、结果准确，符合相关法律法规要求，满足日常检测需要。

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