基于CRISPR/Cas9研究RFX6对斑马鱼胰腺发育的影响

程 呈 吴 谦 卢 晶 仇海燕 李 倩 杨金奎*

(1.首都医科大学附属北京同仁医院内分泌科，北京100730;2.糖尿病防治研究北京市重点实验室，北京100730;3.北京大学生命科学院，北京100871)

RFX转录因子(regulatory factor X-box binding)，是一类翼形螺旋转录因子。近年来的研究［1-3］显示，RFX转录因子与某些人类疾病的发生和发展密切相关。在哺乳动物中，RFX基因与保守的顺式调节元件X-box的结合在27年前被首次发现［1］。随后，RFX家族的成员(RFX1～7)在哺乳动物中被陆续发现，其中RFX6可以通过RT-PCR技术在人类和小鼠的胰腺中检测到，而其他的RFX家族成员则在体内广泛表达［2］。研究［3］发现，RFX6 纯合突变的患者呈现出新生儿糖尿病合并消化系统缺陷的临床症状，包括胰腺发育不全或呈环状，肠闭锁或狭窄，肠旋转不良，胆囊发育不全或缺如等，这些表型被称之为Mitchell-Riley综合征。通过对小鼠的RFX6基因进行敲除，研究人员发现RFX6纯合小鼠大部分不能正常喂养，由于小肠梗阻而出现腹胀肠鸣，并且在出生2 d后死亡。进一步的研究［2］表明，RFX6纯合小鼠除了胰多肽(pancreatic polypeptide，PPY)外，几乎不能产生所有的胰腺激素。以上研究说明RFX6在胰腺的发育中占据重要地位。

与大鼠、小鼠等哺乳类模式动物相比，斑马鱼体型较小、易于饲养、繁殖周期短(7 d左右)、产卵量大(300～1 000枚)、胚胎透明，使得研究者可以借助先进的成像技术，直接在活体胚胎上观察器官的发育［4］。为了进一步研究RFX6基因在胰腺中的功能，本研究拟通过基因敲除技术构建RFX6基因敲除的斑马鱼，用于斑马鱼RFX6基因功能的研究。

目前，随着基因打靶技术的不断革新，研究者［5-10］已经建立了多个高效并且精确的基因打靶新技术，包括Cre/LoxP〔cyclization recombinztion protein/locus of crossing-over(X)inP1〕系统，锌指核酸酶(zincfinger nucleases，ZFN)技术和转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALEN)技术等，并且已经在酵母［5］、线虫［6］、斑马鱼［7-8］、小鼠［9-10］等物种中成功实现了定点突变。但是，这些新技术也不尽完美，各有优缺点。因此，需要一种成本低、效率高、更为简便的基因打靶技术。2013年2月，美国加州大学旧金山分校的研究人员在《Cell》［11］上报道了一种高效并且精确的基因打靶新技术——CRISPR/Cas9打靶系统。

本研究运用CRISPR/Cas9打靶技术，设计了针对RFX6的单导向RNA(single guide RNA，sgRNA)，成功诱导了RFX6的靶向突变，并且该突变可以遗传给下一代。初步筛选后获得了RFX6基因敲除的斑马鱼，可用于斑马鱼RFX6基因功能的研究，为阐释斑马鱼胰腺发育机制提供了动物模型。

1 材料和方法

1.1 实验材料

本实验用AB品系的斑马鱼作为研究材料，在北京大学生命科学院张博教授实验室培育和繁殖。斑马鱼的养殖条件是28.5℃恒温鱼房，14 h光照/10 h黑暗交替循环，养鱼系统保持日夜循环水，每天另补充10%(体积分数)新鲜去离子水。

1.2 实验方法

1.2.1 RFX6基因敲除位点的设计

从斑马鱼基因组网站(http://www.ensembl.org/Danio_rerio/Info/Index)得到RFX6基因的序列和结构信息。遵从CRISPR/Cas9介导的斑马鱼基因组定点突变靶点设计原则，对RFX6基因进行靶向设计。

Cas9靶点要求包含20个碱基的主位点，以及紧邻主位点3’端的PAM区(在20个碱基的主位点之外，由3个碱基构成)。PAM区的序列要求为NGG(N为任意碱基)［12］(图 1)。

RFX6的主位点序列为:5'-GGAATAATCCAGATGGCCCAGG-3'，用限制性核酸内切酶对扩增后的PCR产物进行酶切，酶切完全，电泳后能明显与原条带区分开，证明该Cas9靶点是正确的。筛选出靶点正确的成鱼，后续实验全部选用这批成鱼进行。

1.2.2 gRNA的制备

图1 CRISPR/Cas9作用原理Fig.1 Mechanism of CPISPR/Cas9

1)制备gRNA体外转录模板:根据靶点设计合成含有T7启动子序列的引物序列，即5'-TAATACGACT CACTATA GGAATAATCCAGATGGCCC GTTTTAGA GCTAGAAATAGC-3'(5'下划线部分为T7启动子序列，中间加粗部分为Cas9主位点序列，3'下划线部分为gRNA scaffold序列)。

Tracrrev引物序列，即5'-AAAAAAAGCACCGAC TCGGTGCCAC-3'，用这对引物，以pMD19-gata5_gRNA scaffold(XJW)质粒为模板做PCR，纯化PCR产物，即可得到体外转录gRNA的模板。

2)体外转录gRNA:转录体系如表1所示。

表1 转录体系Tab.1 Transcription system

按照表1转录体系配好20 μL的体系后，放入37 ℃，1 h;然后加入 1 μL TURBO DNase，再次放入37℃，15 min(除去DNA模板);取3μL电泳查看转录效果，然后回收gRNA。

3)回收gRNA(用 ambion的 mirVanaTMmiRNA I-solation Kit):用Rnase-free-H2O将gRNA体系稀释到300 μL，加入330 μL无水乙醇;将上述获得的混合液加入到回收柱中，1 000 g离心15 s，然后加入700 μL miRNA Wash Solution Ⅰ，离心5 ～10 s，再加入500 μL Wash Solution Ⅱ，离心5 ～10 s，2 次;弃去废液，1 000 g离心1 min去除残余的液体，然后加入适量95℃预热的Rnase-free-H2O，离心30 s即可得到gRNA溶液。

1.2.3 显微注射

将Cas9mRNA和gRNA混合注射到一细胞期的斑马鱼鱼卵中，注射量为Cas9 mRNA 300 pg，gRNA 150 pg;取注射后2～4 dpf的胚胎，提取基因组DNA，PCR，酶切检测靶点突变效率。

1.2.4 筛选F0

将突变成功的F0胚胎饲养直至性成熟(90 dpf)，与野生型(wild type，WT)成鱼交配，收集1 dpf胚胎，4个为1组，针对每一条F0分8组提取基因组DNA，做PCR，反应体系为10 μL体系，正向引物为5'-AAATTCTCAATCTGCCGCCG-3'，反向引物为5'-GGCAGCACAAGCAGGATCTA-3'。PCR反应条件为:95℃ 5 min;95 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，33 个循环;72℃ 5 min，自然冷却至室温，PCR产物酶切，回收未切开的条带，连接、转化，TA克隆测序，确定突变类型为3种，分别为:WT:5'-GAAGAAGACCTGGGCCATCTGG-3';+13 bp:5'-GAAGACCTGGG ATTATTAAATAGACCATCTGG-3';+14 bp:5'-GAAGACCTGGG TTATTCCAAGAAGACCATCTGG-3';+22 bp:5'-AAGAAGACCTGGG TTATTCCAAGCCATTAATCCAATAATCTGG-3'。

测序结果如表2所示。将产生上述3种突变的F0斑马鱼与 WT外交，产生大量 F1，筛选 F1(杂合子)。

表2 测序结果Tab.2 Sequencing results

1.2.5 筛选F1

将F1饲养至可以剪尾鳍(大约2个月)，剪尾，提基因组，PCR，酶切(HaeⅢ)，筛选出F1杂合子。带有同一突变的杂合子可以混合饲养。以筛选出的F1作为亲本，建立突变群体。

2 结果

2.1 RFX6基因在斑马鱼胰腺的表达谱

为了研究RFX6基因在斑马鱼胰腺发育过程中的表达情况，采用RT-PCR的方法对多个时间点的斑马鱼胚胎进行分析。结果显示RFX6基因在斑马鱼发育早期(从5hpf到6 d)持续表达(图2)，说明RFX6在斑马鱼胚胎胰腺发育中起重要作用。

2.2 RFX6基因缺失对斑马鱼生长发育的影响

通过F1内交可得到F2，在F2的饲养过程中发现10～14 d时，有部分幼鱼死亡，收集死亡幼鱼尸体，提取基因组，经酶切鉴定大部分为RFX6纯合突变体。为了明确这一现象，集中100条幼鱼进行常规饲养，在10～14 d时陆续收集到16条死亡幼鱼的尸体，经基因鉴定16条中有12条为RFX6纯合突变体。这一数据表明，缺失RFX6基因的幼鱼在发育早期大部分会死亡。

图2 RT-PCR扩增RFX6在斑马鱼发育早期的表达Fig.2 Expression of zebrafish in early development after RT-PCR amplification on RFX6RFX:regulatory factor X-box.

继续饲养F2至可以剪尾鳍，做基因鉴定后发现只有很少的纯合突变体可以长至成鱼，但身体增长明显受阻，体型瘦小，呈现糖尿病消瘦体型，其个体尺寸与野生型对照鱼的差距明显(图3)。其体质量、体长与野生对照组也有明显差异。RFX6纯合突变体发育至性成熟(90dpf)后与WT交配，没有后代产生。

3 讨论

胰腺的发生是一个复杂的过程，需要多种基因参与调控。找到与胰腺发育相关的关键基因并利用基因敲除手段研究这些基因的表达与功能，有助于更深入的了解胰腺的发育过程及其中的分子调控机制，这对于研究临床医学中内分泌疾病的病理机制，以及制定有效的治疗方案乃至开发新药都有着重大意义。

图3 斑马鱼体型对比Fig.3 Contrast of zebrafish

随着大量物种基因组测序的完成，探究关键基因的作用和功能变得愈为重要。目前的研究方法主要依赖于基因敲除和转基因技术，随着基因敲除技术的日益成熟，一些高效、精确的技术随之出现，包括Cre/LoxP、ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9 等。本研究利用CRISPR/Cas9基因打靶新技术，成功构建了斑马鱼模型，为进一步研究RFX6基因在斑马鱼胰腺发育中的作用提供了有效的研究模型。从本研究结果来看，RFX6基因在斑马鱼发育早期从5 hpf到6 d持续表达，说明RFX6在斑马鱼胚胎胰腺发育中起重要作用。更为重要的是，完全缺失RFX6的斑马鱼在发育早期大量死亡，仅有极个别个体能存活到成年，但是身体增长明显受阻，体型瘦小，呈现糖尿病消瘦体型。

基于上述研究，本研究还有尚待深入之处。为了研究RFX6在胰腺胚胎发育中的作用，以及解释纯合突变体在发育早期大量死亡和长至成鱼的纯合突变体呈现消瘦糖尿病体型的原因，下一步工作包括两个方面:首先，利用原位杂交技术探究胰腺主要表达基因［13-15］，如标记内分泌腺的胰岛素(insulin)、胰高血糖素(glucagon)、生长抑素(somatostatin)以及标记外分泌腺的Trypsin等，在RFX6纯合突变体中的表达情况;其次，利用RT-PCR技术对这些胰腺表达基因进行半定量分析，利用实时荧光定量PCR技术对这些胰腺表达基因进行定量分析。这两个方面是后续研究的主要方向。

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