复制性衰老减弱人胚骨髓间充质干细胞静脉移植治疗大鼠脑梗死的疗效

黄爱华 张萍萍 张 斌 马步青 关云谦 周逸丹*

(1.浙江省杭州市第三人民医院急诊科，杭州310000;2.首都医科大学宣武医院细胞生物室，北京100053)

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是在机体内广泛存在的一种具有多向分化潜能的干细胞。MSC免疫源性很低，只表达主要组织相容性抗原(major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ类分子，不表达MHCⅡ类分子，同种异体移植后不会引起显著的免疫排斥反应。MSC具有高效的免疫调节作用，能减弱体内非特异的炎性反应，近些年来在疾病动物模型和临床研究上MSCs被尝试应用于治疗慢性炎性反应和免疫紊乱相关的疾病［1］。

具体到神经系统，MSC能够减少脑内淋巴细胞浸润，减弱小胶质细胞激活等，另外，MSC还能产生或者促使宿主产生多种营养性细胞因子，促进缺血区组织的修复。已经有研究［2］发现MSC经过静脉移植治疗动物脑梗死模型会产生一定的治疗效果，表现为梗死体积减小、动物行为学改善，治疗的机制和MSC减轻脑内以小胶质细胞激活为核心的炎性反应以及产生多种细胞因子有关。

MSC是一种成体干细胞，体外培养经过多次传代后，也会发生衰老的现象。衰老往往意味着功能的下降，对治疗效果造成不利影响［3］。具体到用人类MSC治疗大鼠脑梗死的实验研究，还缺乏同时观测不同衰老程度的MSC细胞植入脑内后的营养作用和脑内炎性反应的实验研究，对比不同衰老程度的MSC治疗脑梗死的疗效有利于今后研究提高细胞治疗疗效的方法［4］。

本实验中笔者采用不同代次人类骨髓MSC移植给大鼠脑梗死模型的方法，观察移植后疗效以疗效产生机制。采用连续传代的复制性衰老法可制作MSC体外衰老模型。β-半乳糖苷酶(β-gal)的活性是最广泛使用的检测衰老的标记。原理是随着传代次数的增加衰老不断进行，衰老细胞的溶酶体内β-半乳糖苷酶水平增高，β-gal染色的细胞比例会增加，染色会逐渐增强［5］。

疗效产生机制方面主要观察脑内以小胶质细胞增生为代表的炎性反应，还有以脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、胰岛素样生长因子(insulin like growth factor-1，IGF-1)等为代表的营养因子产生两方面的情况。

脑梗死发生后，小胶质细胞的激活程度在一定程度上代表了脑内炎性反应的强弱程度。小胶质细胞可认为是脑中潜在的巨噬细胞和脑缺血后脑内炎性反应密切相关。小胶质细胞在脑缺血后几分钟激活，同时产生多种促炎性反应因子，如白介素-1β(interleukin，IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factorα，TNF-α)等又可导致小胶质细胞的进一步活化［6］。在脑缺血发生后抑制小胶质细胞活性，可减少脑梗死体积，对脑组织起保护作用［7］。

根据文献［8］报道，众多营养性的细胞因子可能是脑梗死后发挥修复作用的重要因素。这些因子中作用比较重要的两个因子可能是BDNF和IGF-1。脑室内或经静脉注射BDNF，都可以有效地减小梗死体积。如果将数种营养性细胞因子的基因分别转入MSC然后移植到脑实质内，转入BDNF、胶质细胞源性神经营养因子(glial cell derived neurotrophic factor，GDNF)的MSC移植也有明显的治疗效果，而神经营养因子3(neurotrophin 3，NT3)，睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)则疗效不明显［9］。无论是脑内的还是血液循环中的IGF-1都有神经保护作用，而且IGF-1可以通过血-脑脊液屏障。脑梗死后梗死灶的核心区可以发现IGF-1的升高，如果梗死后立体定向给予动物IGF-1，可以明显观察到治疗效果;即使静脉输注IGF-1也可以改善动物的行为缺损，并且减小梗死体积［10］。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 组织标本和实验动物

人骨髓来自产科自然流产的胎儿，周龄为18～20周。获得产妇知情同意和医院伦理委员会批准。SPF级SD雄性大鼠120只(体质量280g左右)，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物许可证编号:SYXK(京)2015-0016。大鼠自由进水进食。动物实验分3部分，每部分40只大鼠，分为4组，分别是假手术组(Sham)，缺血对照组〔在缺血后尾静脉给予0.9%(质量分数)的氯化钠注射液〕、缺血后尾静脉给予第4代MSC组和第10代MSC组。第一部分实验对比移植后2 d的梗死体积，第二部分实验用免疫组化染色鉴定移植后4 d小胶质细胞激活;第三部分实验检测移植后4d各组动物脑内营养性细胞因子的量。动物行为学评价在第二、三部分实验进行。

1.1.2 试剂

低糖DMEM、DMEMα、胎牛血清、青链霉素、谷氨酰胺、0.05%(质量分数)胰蛋白酶、DPBS等购自美国Life Technology公司。人MSC流式鉴定抗体试剂盒购自R＆D公司。大鼠BDNF、IGF-1的ELISA检测试剂盒购自B＆D公司。抗小胶质细胞CD 68抗体购自美国Cell signaling公司。TTC(2，3，5一氯化三苯基四氮唑)购自美国Sigma公司。脑组织匀浆液购自美国Invitrogen公司。

1.1.3 主要仪器

美国Thermo超净工作台、培养箱，美国BD公司FACS Calibur流式细胞仪。日本Nikon相差显微镜。白洋离心机。美国Bio-Rad 3500全波长酶标仪。美国Surgivet小动物麻醉机。德国Zeiss手术显微镜，Leica SPⅡ共聚焦显微镜和照相系统。

1.2 实验方法

1.2.1 胎儿骨髓MSC的提取和流式细胞仪鉴定

在无菌条件下，分离自然流产胎儿的肱骨、股骨和胫骨。用DMEM低糖冲洗骨髓到培养皿中，完全培养基〔DMEM低糖+10%(体积分数)FBS〕重悬细胞，细胞浓度大约为1×106/mL培养基。37℃，5%(体积分数)CO2培养48 h后，轻轻晃动培养皿，去掉未贴壁细胞，DPBS清洗2次，加入完全培养基。以后每2.5 d换液，待细胞长到80%融合度时，用0.05%(质量分数)胰蛋白酶消化后1∶3传代。

取第4和10代生长状态良好的MSC。用胰酶消化成单细胞并计数，按照MSC表面标志抗体检测试剂盒的说明进行鉴定。

1.2.2 MSC衰老染色

待细胞长至50%～70%满时弃去细胞培养基，PBS洗涤细胞2次，每次3 min，小心去除PBS。加入1×Fixation Buffer，室温下固定细胞6～7 min。在固定细胞的同时配制衰老染液，并用0.22 μm的滤器过滤待用。弃去固定液，3 min×3次洗涤细胞。每孔中加入过滤后的衰老染液，密封，37℃孵育12 h，弃去染液，洗涤细胞3 min×3次。显微镜下观察并拍照。

1.2.3 动物模型和细胞移植

采用远端大脑中动脉梗阻(distal middle cerebral artery occlusion，dMCAO)模型［11］。模型组开颅电凝大脑中动脉远端使其闭合，并夹闭双侧颈总动脉30 min;假手术组开颅并颈部切开，但不对大脑中动脉、双侧颈总动脉进行操作。其余步骤与模型组相同。

MSC细胞经0.05%(质量分数)胰蛋白酶消化后，0.9%(质量分数)氯化钠注射液洗去残留培养基，然后取106细胞重悬在0.1 mL 0.9%(质量分数)氯化钠注射液中置于冰上备用。缺血对照组在梗死后1 h经尾静脉输注0.9%(质量分数)氯化钠注射液，细胞治疗组于颈缺血后1 h经尾静脉注入106人类骨髓MSC或者MNC。

1.2.4 梗死体积测定

于脑梗死后48h，将大鼠麻醉后直接取脑，去除小脑和嗅球。将大脑放在冰预冷的平皿上从前向后每隔2 mm切一片，通常切成6～7片。将切片置于2%TTC中染色，37℃，20 min后拍照。TTC染色完成后使用Image J计算机图像分析系统计算大鼠脑梗死体积。首先计算出每个层面脑片的梗死面积，为避免因脑水肿产生数据误差，笔者使用梗死体积=(对侧半球面积-患侧正常脑组织面积)×脑片厚度。然后计算相对梗死体积，相对梗死体积=梗死总体积/对侧半球总体积。

1.2.5 大鼠脑梗死区BDNF、IGF-1的ELISA检测

大鼠脑梗死模型细胞移植后7 d，取梗死区脑组织，4℃预冷的PBS洗掉血渍，用滤纸吸掉PBS，加入组织匀浆液充分匀浆，4℃，15 000 r/min离心1 h，取上清。按照ELISA试剂盒的要求检测脑组织中BDNF、IGF-1的量。

1.2.6 行为学测试

1)圆柱容器实验(cylinder test)

用于对比缺血后前肢使用的差异，大鼠放入玻璃烧杯，直径15 cm，高22 cm，这样的空间促使大鼠经常用后肢站立(rearing behavior)，然后用前肢接触玻璃容器壁。在10 min内连续观察，发生小于20次触壁事件的大鼠去除。统计依据为:按照公式(健侧前肢运动-患侧前肢运动)/(健侧前肢运动+患侧前肢运动+双侧运动)计算出的数值。

2)爬格实验 (grid walking test)

将大鼠放置在金属网格上行走，网眼大小为3.3 cm×3.3 cm，计数大鼠爬行1.5 m的距离其左侧前肢掉下网格的次数。计算公式为:(脑病变对侧前爪的错步数-病变同侧前爪的错步数)。其分值如为正数表明脑病变对侧功能缺损，如为负数表明脑病变同侧功能缺损。

1.2.7 大鼠小胶质细胞CD68染色和定量分析

大鼠脑梗死模型细胞移植后4 d，深麻醉后4%多聚甲醛灌注固定。本实验采用的dMCAO模型梗死灶在顶、颞叶皮质，检测范围是前囟向后4 mm内的脑组织，此范围的脑组织皮质都含有梗死灶。经连续40 μm厚度冠状切片之后，可得100张切片，每隔10张取一张进行分析。

切片用0.01 mol/L PBS缓冲液清洗2次，使用含有0.3%(体积分数)Triton X-100的 PBS孵育30 min，使用封闭液〔含有1.5%(体积分数)的山羊血清和1%(质量分数)BSA的0.01 mol/L PBS缓冲液〕室温孵育1 h，使用含有Anti-CD68抗体的封闭液4℃孵育过夜。次日，用0.01 mol/L PBS缓冲液清洗3次，使用含有Cy3荧光标记的二抗(1∶200)的封闭液室温孵育1 h，用0.01 mol/L PBS缓冲液清洗3次。使用浓度为100 ng/mL的 DAPI(4'，6-diamidino-2-phenylindole)PBS溶液做细胞核染色15 min，用0.01 mol/L PBS缓冲液清洗3次，用含有10%(体积分数)甘油的0.01 mol/L PBS溶液封片。

用100×荧光显微镜对选取的切片的梗死区皮质照相，Image J软件标记梗死区皮质1 mm×1 mm范围，并计算检测范围内CD68染色的丰度(abundance)。梗死后输注0.9%(质量分数)的氯化钠注射液的对照组、梗死后移植组分别和假手术组的丰度值比较所得的比值为相对丰度(relative abundance)［12-13］。

1.3 统计学方法

采用SPSS 10.0处理数据。计量数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验或单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人骨髓MSC采集、培养和流式细胞鉴定

分离的原代人骨髓MSC培养3～5 d，可见有梭形、多角形细胞贴壁。原代培养第10～12天，培养细胞达到80%融合，此时即可进行1∶3传代，之后每3～5 d传代一次。传代到第10代的MSC发生一些细胞形态的特征性改变，包括细胞大而扁平、核质比下降，胞内颗粒增加(图1A)。

流式细胞仪检测第4和10代的人骨髓MSC的特异性表面抗原类似。以第10代为例，不同代次的BM-MSC 细胞表面都表达 CD90、CD73、CD44、CD105(图1B-E)，其中第4代细胞的阳性率都高于96%，第10代细胞的检测阳性率为93% ～96%，第4和10代差异无统计学意义。第4、10代细胞都不表达CD34、CD19、CD45、CD11b;而且也不表达 MHC-Ⅱ类分子—HLA-DR(图1F)。

2.2 MSC衰老的鉴定

除进行形态观察外，体外复制性衰老的MSC经过β-gal染色后，着色细胞的比例从第4代(图2A)的(4.21±1.35)% 增加到第10代(图2B)的(52.43±6.47)%，差异有统计学意义，而且第10代细胞的着色程度明显深于第4代。

2.3 梗死体积测定

术后48 h，深麻醉并立即处死大鼠取脑进行TTC染色，观察梗死体积。各实验组大鼠的代表性TTC染色如图3。缺血对照组的梗死体积百分比为(35.62±5.40)%(图3A);植入第4代人骨髓MSC的相对梗死体积达到(31.26±4.32)%(图3B);而植入第10代MSC细胞的相对梗死体积为(34.14±3.89)%(图3C);经过统计检验，第4代MSC细胞治疗组比缺血对照组的梗死体积显著缩小，差异有统计学意义(P＜0.01)。第10代人MSC细胞移植后对动物梗死体积没有显著影响(P＞0.05)(图3D)。

2.4 脑梗死区中BDNF、IGF-1的测定

经过静脉植入的人类细胞可能促使大鼠脑内的细胞因子浓度升高。其中BDNF、IGF-1是已知脑梗死后动物脑内产生的重要细胞因子。可见细胞移植组和给予0.9%(质量分数)氯化钠注射液的缺血对照组相比，第4代MSC治疗组显著提高了这2种细胞因子的浓度(P＜0.05)(图4A-B);第10代MSC没有增高BDNF、IGF-1的浓度。

2.5 行为学检测

本实验中细胞移植对行为学的改善只在移植后2 d较为明显，而第4天则没有观察到(图5)。

图1 人骨髓MSC培养及特征性表面抗原流式细胞仪检测Fig.1 Human bone marrow MSC culture and specific surface marker identification by cytometry

脑梗死发生后，梗死对侧运动功能受损，在圆柱容器实验中梗死侧肢体的使用频率比对侧显著升高，根据公式计算可得梗死后第2天为(20.44±7.09)%，给予第4代人骨髓MSC可以在移植后第2天达到(14.78±6.83)%，和对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05);给予第10代MSC达到(16.78±4.76)%，差异无统计学意义。移植后第4天，缺血对照组测试得分(15.56±1.94)%，给予人MSC组达到(14.22±2.63)%，而给予第10代组(15.0±7.22)%，移植组和缺血对照组差异均无统计学意义(图5A)。

爬格实验显示出类似的治疗效果。脑梗死后第2天，脑病变对侧前爪的错步数明显增加，梗死后给予0.9%(质量分数)氯化钠注射液的对照组两侧前肢错步数为6.50±1.26，MSC移植则只能够在梗死后第1天显著改善大鼠的行为缺损，评分为5.13±0.96(P＜0.05);此时的第10代细胞移植后动物错步数为5.53±1.14，和缺血对照组差异无统计学意义。

图2 体外培养MSC的衰老鉴定Fig.2 Identification of in vitro cultured hMSC senescence

图3 人MSC经尾静脉移植减小大鼠急性脑梗死模型的梗死体积Fig.3 Intravenous transplantation of hMSCs through caudal vein decreased the infarct volume of acute rat cerebral ischemia

图4 hMSC细胞移植对大鼠脑梗死皮质区BDNF、IGF-1量的影响Fig.4 Transplantation of hMSC increased the BDNF、IGF-1 in the core area of ischemia rats

移植后第4天，缺血对照组错步数为5.53±1.26，第4、10代细胞移植组分别为4.9±1.18和5.18±1.26，移植组大鼠行为都没有明显改善(图5B)。

图5 不同代次人骨髓MSC移植对脑梗死大鼠行为的影响Fig.5 The effect of transplantation hMSC at passage 4 and 10 on the behavioral outcome of cerebral ischemia rats

2.6 脑梗死区小胶质细胞激活

小胶质细胞是中枢神经系统炎性反应的枢纽，其激活状态通常可以代表脑内炎性反应的强弱。图6示皮质梗死区CD68抗体识别的小胶质细胞，CD68染色阳性细胞通常被认为处于激活状态。脑梗死发生后，缺血对照组的皮质梗死核心区CD68的丰度显著升高，可达到假手术对照组的(2.75±0.51)倍(图6A，D)。给予细胞治疗后，第4代人MSC细胞可使CD68的丰度降低到假手术组的(1.97±0.32)倍(图6B，D)，给予第10代MSC细胞的治疗组能够降低CD68的丰度到假手术组的(2.35±0.43)倍(图6C，D)。只有第4代MSC显著减低了小胶质细胞的数量。

3 讨论

脑梗死后的治疗还没有特别有效的手段，特别是脑梗死发生早期的脑保护和发生后期的损伤修复目前仍是个难题［14-15］。脑梗死修复时需要重建血管系统，提供营养因子，改善脑内慢性炎性反应环境等，能够同时满足这些需要的只有细胞移植途径。

MSC细胞体外共培养可以有效地抑制淋巴细胞增生和促炎性因子的释放，已经有应用于移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)和风湿病的治疗。另外，MSC具有很强的旁分泌能力，可为损伤或新生的组织细胞提供多种重要的营养物质和保护因子，这些特性使MSC具有参与临床治疗脑梗死的可能。

作为一种成体干细胞，MSC不具有无限增生能力。体外培养的正常细胞在分裂到一定次数时即逐渐丧失增生能力并最终出现永久性生长停滞，但细胞并没有死亡的现象，就是体外复制性衰老。不难推断，随着MSC的衰老，其各种功能都可能下降，进行脑梗死治疗的疗效会相应下降，但这一推断还没有经过详细的检验。

图6 不同代次MSC移植对大鼠脑皮质梗死区小胶质细胞CD 68染色的影响Fig.6 CD 68 staining of the infarct cortex core area after the transplantation of hMSC at passage 4 and 10

本实验发现，MSC培养扩增后通过流式细胞仪鉴定特征性的表面抗原，第4和10代的人骨髓MSC的免疫表型差异无统计学意义。这就可以确定植入的是人MSC。通过连续体外传代，第10代MSC相对第4代发生了明确的衰老现象，表现为β-gal染色比例增加。

从治疗效果上看，只有第4代细胞减小了梗死体积，且在移植后第2天改善了动物的行为学缺损。第10代细胞没有显著减小梗死体积，第2、4天对动物行为有改善作用，但差异无统计学意义。可以明确，第10代细胞显示出一些治疗效果的倾向，但第4代细胞的治疗效果明显好于第10代细胞。

目前认为细胞移植治疗脑梗死产生疗效的效果主要有3点:1)植入细胞分化成为神经细胞;现在已经认为这不是主要因素。以MSC为例，植入的MSC大多数会在肺部滞留，而且植入细胞的信号迅速减弱，通常在移植后1周消失，这说明静脉输入的细胞最终入脑的非常少，即使植入的细胞分化成为神经元，其总量对于治疗而言也太少［16］;2)植入细胞产生调节微环境的作用。现在研究的热点主要是MSC细胞的减弱炎性反应，调节周围微环境的作用［4］。3)植入细胞产生多种营养性的细胞因子，可以保护神经细胞，促进血管新生等。

脑内炎性反应是脑梗死后脑内组织损伤的重要机制之一，脑内炎性反应的标志是淋巴细胞浸润和小胶质细胞、星型胶质细胞的激活［17-18］，其中激活的小胶质细胞会通过细胞间相互作用及分泌细胞因子参与逐渐增强的炎性反应［19-21］。

小胶质细胞的标志性染色可以用Iba-1和CD68(ED-1)，通常情况下认为Iba-1代表静息状态的小胶质细胞［22-23］，这些细胞可能在损伤早期起到了一定的保护作用［24］，但最近也有研究［13］成果把 Iba-1 当做激活的小胶质细胞的标志物。CD68通常被认为是激活的小胶质细胞，是脑内炎性反应损伤的重要参与者［25］。所以在本实验中，笔者主要检测了CD68阳性的小胶质细胞。

本实验中发现第4代MSC细胞都具有减弱梗死区小胶质细胞激活的作用，而且第4代细胞的作用强于第10代细胞。间充质干细胞的免疫调节原理近年来得到了广泛深入的研究，直接脑内注射的MSC可以减轻脑梗死大鼠脑内的炎性反应［2］;静脉输注的MSC亦可以减弱脑内炎性反应，Wang等［26］在脑梗死后24 h用人MSC细胞系B10经静脉输注后，发现在脑梗死核心区，ED-1阳性小胶质细胞被显著下调，参与炎性反应的重要的中间分子(Nuclear factor-κB，NF-κB)被下调，受 NF-κB 调节的 IL-1β、MCP-1，诱导型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)等的表达都显著下降。这些研究和本实验的差别在于细胞植入时间和观察时间等等。根据笔者的实验结果并综合这些研究成果，可以肯定，MSC移植治疗脑梗死的确具有一定的治疗效果，而且治疗效果和MSC抑制脑内炎性反应有关。

另一个产生疗效的机制是植入细胞产生或者诱导宿主产生营养性的细胞因子。静脉输注hMSC会导致心肌梗死模型大鼠心脏内多种细胞因子升高，例如BDNF、血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)、神经生长因子(nerve growth factor，NGF)、胶质源性神经生长因子(glial cell-line derived neurotrophic factor，GDNF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)等［27］。

植入的细胞可以产生人类来源的细胞因子，也可以诱导宿主产生大鼠源性的细胞因子。具体到移植治疗脑梗死，目前的研究结果更多地倾向于认为是大鼠源性的营养性细胞因子在发挥减轻梗死后脑组织损伤的作用，例如有实验［28］发现，静脉输注人类MSC，在脑内梗死区周边只有IGF-1略有升高，其他的因子升高不明显，而植入的MSC却促进了多种大鼠源性的细胞因子的显著升高。Steinberg等［13］将5×106人类脐带来源的MSC细胞或者单个核细胞经动脉植入大鼠，没有检测到明显的人类来源的细胞因子，笔者的实验中移植的人类细胞数量更少，只有1×106，所以直接检测了大鼠源性细胞因子。

总之，第10代细胞并没有显著治疗效果，造成这一现象的原因首先可能是，静脉植入的MSC细胞对大鼠脑梗死区的作用包括营养和减少小胶质细胞两个方面，第10代细胞不能有效地抑制小胶质细胞，也没有明显地促使动物脑内营养性细胞因子增加。这一结果对临床实验中选择MSC的传代次数有重要的参考意义。本实验还提示了今后的一些研究方向，例如，除了BDNF和IGF-1，还有哪些营养性细胞因子参与了MSC对脑梗死脑组织的修复;小胶质细胞作为脑内炎性反应的中枢，其具体通过哪些因素来对脑组织造成损伤;除了小胶质细胞之外，MSC是否有效抑制了炎性反应的其他方面，例如中性粒细胞浸润等。

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