肝刺激因子稳定转染人肝癌细胞系的方法建立与表达鉴定

吴 媛 张 静 董凌月 安 威

(首都医科大学基础医学院细胞生物学系肝脏保护与再生调节北京市重点实验室，北京100069)

肝脏是一种具有多样而复杂的生物学功能的人体生命器官，具有很强的再生功能，肝损伤引起的肝细胞数量减少和肝部分切除均可启动肝脏再生过程［1］。包括激素、生长因子以及细胞因子在内的多种物质均参与肝再生的调节，其中肝刺激因子(hepatic stimulator substance，HSS)目前受到广泛的关注。HSS是1975年La Brecque从新生大鼠肝脏或鼠再生肝脏中分离到的一种活性物质，由于具有特异性刺激肝细胞增生的特点，故谓之肝刺激因子［2］。HSS已被证明是唯一具有肝特异性的细胞因子，广泛存在于哺乳动物胚胎肝、幼胎肝以及再生肝胞浆液中，并且是由肝细胞自身分泌的［3］。除去上述的刺激肝细胞增生外，HSS还具有保护肝细胞免于CCl4、氨基半乳糖等毒物对肝脏的特异性损害［4-6］。它具有抗酸耐碱耐热等特点并带强负电荷(相对分子质量介于14 000～20 000)［7］。HSS作为肝细胞源性活性因子可能在肝再生过程中发挥重要调控作用，但具体机制仍不甚清楚。因此本研究利用本实验室已构建成功的Flag-HSS-pcDNA3.0质粒，转染BEL-7402细胞，建立了稳定表达HSS的细胞系，为深入研究HSS的生理功能提供实验工具和研究基础。

1 材料和方法

1.1 材料

BEL-7402细胞系(首都医科大学基础医学院细胞生物学系保存);高糖DMEM培养基(美国Hyclone公司);胎牛血清(美国Gibco公司);FuGENE HD转染试剂(瑞士Roche公司);Mitotracker染剂(美国Molecular Probes公司);SYBR Green PCR Master Mix(德国GIAGEN公司);BCA蛋白质定量试剂盒(美国Thermo公司);化学发光试剂盒(美国Bio-Rad公司);HSS多克隆抗体(美国Santa Cruz公司);Flag单克隆抗体(美国Sigma公司);辣根过氧化物酶标记的抗GAPDH抗体(上海康成公司);羊抗鼠IgG抗体-辣根过氧化物酶，羊抗兔IgG抗体-辣根过氧化物酶(北京普利莱公司)。

1.2 细胞培养

无菌条件下，在相对湿度95%、5%(体积分数)CO2、37℃恒温二氧化碳培养箱中培养BEL-7402细胞(人原发性肝癌细胞系)，培养液为含体积分数为10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、含有青霉素(100 μg/mL)和链霉素(100 μg/mL)的高糖 DMEM培养基。每24～48 h进行一次传代，取对数生长期的细胞进行实验。

1.3 稳定转染

按FuGENE HD转染试剂说明书的操作方法将Flag-HSS-pcDNA3.0(本室保存)转染入BEL-7402细胞系中。转染前1 d按3×105/mL的密度接种细胞于6孔培养板中，使细胞达到80% ～90%的汇合率。用无抗生素无血清的opti-MEM培养液稀释质粒DNA(2 μg)至终体积100 μL;在培养基中加入4 μL脂质体，涡旋1～2 s，室温15 min;将6孔板中的培养基弃去，换用新鲜无抗生素的10%(体积分数)FBS的DMEM培养基900 μL;加入含有质粒和转染试剂的混合物100 μL，于5%CO2、37 ℃的条件下培养24 h 后，加入无抗生素含10%(体积分数)FBS的DMEM培养基2 mL。转染24 h后按1∶5传代，用600 μg/mL终质量浓度的G418进行筛选，约12～15 d后肉眼可见单克隆细胞团，挑取单克隆细胞团，用含有300 μg/mL G418的DMEM培养基进行扩大培养，之后收集细胞并分别提取转染细胞和野生型细胞的蛋白质和mRNA，进行Western blotting和real-time PCR实验。

1.4 免疫荧光(immunofluorescent，IF)

将厚为0.1 mm直径为12 mm的盖玻片放入24孔板，将野生型细胞和转染细胞按2.5×105/孔接种于24孔板中，之后细胞贴壁于玻片上形成细胞爬片;用含10%(体积分数)FBS的完全培养基培养细胞24 h后，加入200 μL含 Mitotracker染剂的 PBS(终浓度200 nmol/L)，37℃孵箱中避光染色25 min;PBS洗涤并加入4%(质量分数)多聚甲醛，室温固定细胞15 min;PBS洗涤，用 500 μL 0.2%(体积分数)TritonX-100通透细胞，用500 μL 5%(质量分数)BSA进行封闭30 min;每孔加入按1∶4 000稀释的anti-Flag抗体，4℃过夜孵育;加入按1∶500稀释的Alexa Flour 594荧光二抗，于室温避光平缓摇动1 h;DIPA复染细胞核;用激光扫描共聚焦显微镜进行观察。

1.5 实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)

PCR反应扩增条件:50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，此条件进行40个循环。将所扩增得到的PCR产物同时进行溶解曲线分析。18 s的Tm为84℃，HSS的Tm为87℃。检测的临界点在PCR扩增过程中，荧光信号从本底进入指数增长阶段时的拐点所对应的循环数(Ct)看作模板初始浓度的间接指标。结果用18 s进行校正。用ΔΔCt法计算相对基因表达，确定HSS mRNA相对定量。

1.6 Western blotting 分析

将细胞消化成单细胞悬液，在4℃条件下用细胞裂解液得到细胞蛋白，按 BCA蛋白检测试剂盒中的方法进行蛋白定量，配制聚丙烯酰胺凝胶(5%浓缩胶和12%分离胶)，50 μg待测样品与上样缓冲液共25 μL混匀后，99℃ 加热10 min使蛋白变性。然后按顺序加待测样品及预染蛋白标准品上样，浓缩胶80 V，进入分离胶后改为120 V恒压电泳约1.5 h。之后进行膜转印，5% 封闭液(1.25 g脱脂奶粉+25 mL TBST配制)室温封闭1 h，封闭结束后，将硝酸纤维膜放入按1∶5 000稀释的一抗稀释液中，摇床上4℃ 过夜;TBST冲洗3次，加入二抗(辣根过氧化物酶标记抗IgG抗体，1∶10 000稀释)，室温孵育1 h后，TBST冲洗3次，进行化学发光显色。洗膜后孵育内参GAPDH，结果用密度分析软件进行分析。

1.7 统计学方法

应用SPSS 11.0对实验结果进行统计学分析。计量数据使用均数±标准差(±s)表示，组间比较使用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 稳定转染细胞系的筛选

Flag-HSS-pcDNA3.0转染入BEL-7402细胞，经600 μg/mL G418维持筛选后，大约13 d后抗G418(图1A)细胞初步形成单克隆，挑取单克隆细胞进行扩大培养;首先移至96孔板中，每孔1个单克隆细胞团，细胞覆盖率80%以上时转移至24孔板，如此依次扩大培养至12孔板、6孔板和60 mm培养皿中，期间保持每种单克隆细胞的独立性，即不与其他克隆交叉(图1B)。将最终获得的细胞命名为HSS-expressing细胞。

图1 稳定转染细胞系的筛选Fig.1 Screening of stable transfected cell clones

2.2 免疫荧光染色观察 HSS-expressing细胞中HSS的定位

野生型BEL-7402细胞和HSS-expressing细胞通过免疫荧光染色，用激光扫描共聚焦显微镜观察显示(蓝色荧光代表经DAPI染色的细胞核，红色荧光代表经Mitotracker染色的线粒体，绿色荧光代表经Flag标记的HSS):在野生型的BEL-7402细胞中，只有红色荧光线粒体而没有绿色荧光Flag-HSS;而在HSS-expressing细胞中，既有红色荧光线粒体又有绿色荧光HSS的表达，叠加后显示黄色(图2)，这些结构提示，成功将HSS基因整合入BEL-7402细胞的基因组中，HSS基因可以稳定表达并定位于线粒体中。

图2 激光共聚焦显微镜观察转染HSS在BEL-7402细胞内表达及定位Fig.2 Expression and localization of HSS in BEL-7402 cells transfected HSS by confocal microscopic

2.3 HSS在稳定转染细胞系中mRNA的表达

为了进一步鉴定HSS-expressing细胞中HSS的表达情况，提取细胞的总RNA后，进行real-time PCR试验。结果显示:野生型BEL-7402和HSS-expressing细胞中HSS基因均有表达，而 HSS-expressing细胞中HSS表达较野生型细胞显著上调(图3)。

图3 HSS mRNA在稳定转染细胞系中的表达Fig.3 Analysis of HSS mRNA expression in wild type cells and BEL-7402 cells transfected HSS

2.4 HSS在稳定转染细胞系中蛋白质水平的表达

通过Western blotting方法进一步鉴定提取的野生型BEL-7402细胞和HSS-expressing细胞中HSS蛋白质表达和两种细胞中带Flag标签的HSS融合蛋白的表达情况。如图4A所示，HSS-expressing细胞中HSS蛋白质表达较野生型细胞增加了6.8倍;而带Flag标签的HSS融合蛋白在HSS-expressing细胞中表达同样明显高于野生型细胞(图4B)。这些结果均提示，HSS在HSS-expressing细胞可以稳定的高表达，可用于下一步的HSS功能的研究。

3 讨论

HSS又称为肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration，ALR 或 growth factor，augmenter of liver regeneration，GFER)［8-10］。从 1975 年发现至今，由于其在肝脏保护、促肝细胞增生及抑制凋亡等方面发挥重要作用，一直备受人们关注［11-14］。新近研究［15］显示，利用条件性基因敲除技术，将肝脏内的HSS选择性的沉默后，肝脏很快发生脂肪性变性，并在正常饲养下，逐步发展成肝脏纤维化及肝癌。HSS作为一种线粒体蛋白，如何影响肝脏脂质代谢，是目前HSS研究中需要解决的问题。

将基因克隆到真核表达载体中，转染至宿主细胞，观察宿主细胞的变化是研究基因功能及相关机制的一种有效方法。本研究应用阳离子脂质体介导法将重组质粒Flag-HSS-pcDNA 3.0成功转染入人肝癌BEL-7402细胞后，选择按1∶5的比例，进行第一次传代。通过G418筛选13 d后，获得了具有抗性的阳性单细胞克隆。在实验中，同样选择了1∶4和1∶6的比例，虽然1∶4的传代比例相对于1∶5的比例，出现细胞克隆更早且更多，但是由于细胞密度大，导致细胞克隆并非始于单个祖细胞，不利于后续实验。而1∶6的比例，由于细胞过少，不容易生长出细胞克隆，增加了筛选的难度。这个比例的建立，增加了获得阳性单细胞克隆的几率，可用于其他稳定转染实验。

获得了稳定转染的HSS-expressing细胞系后，分别应用real-time PCR和Western blotting方法从转录和翻译两个水平鉴定此细胞系是否正确表达HSS，结果显示HSS在稳定转染细胞中可以被有效的转录和翻译。由于选用的真核表达载体含有Flag标签蛋白，本课题组还利用抗Flag标签的抗体检测细胞中HSSFlag融合蛋白的表达，结果证实了稳定转染细胞系建立成功。应用免疫荧光技术，可以观察单个细胞内基因的表达及分布。为此又进行了免疫荧光实验，利用激光共聚焦显微镜可以观察到，每个HSS-expressing细胞均有HSS的表达，且主要定位于线粒体中，与既往研究［16］相符，进一步证实了HSS-expressing细胞可以有效准确的表达HSS，并且具有良好的抗体结合活性，可以用于后续的研究。

综上所述，本课题组成功的构建了HSS稳定表达的细胞系，为研究HSS的生物学功能及相关机制提供了良好的细胞模型及研究工具。

［1］ LaBrecque D R，Steele G，Fogerty S，et al.Purification and physical-chemical characterization of hepatic stimulator substance［J］.Hepatology，1987，7(1):100-106.

［2］ Daugas E，Susin S A，Zamzami N，et al.Mitochondrio-nuclear translocation of AIF in apoptosis and necrosis［J］.FASEB J，2000，14(5):729-739.

［3］ Fischer U，Janicke R U，Schulze-Osthoff K.Many cuts to ruin:a comprehensive update of caspase substrates［J］.Cell Death Differ，2003，10(1):76-100.

［4］ Desagher S，Martinou J C.Mitochondria as the central control point of apoptosis［J］.Trends Cell Biol，2000，10(9):369-377.

［5］ Ferrari D，Stepczynska A，Los M，et al.Differential regulation and ATP requirement for caspase-8 and caspase-3 activation during CD95-and anticancer drug-induced apoptosis［J］.J Exp Med，1998，188(5):979-984.

［6］ Mancini M，Nicholson D W，Roy S，et al.The caspase-3 precursor has a cytosolic and mitochondrial distribution:implications for apoptotic signaling［J］.J Cell Biol，1998，140(6):1485-1495.

［7］ Parrish J，Li L，Klotz K，et al.Mitochondrial endonuclease G is important for apoptosis in C.elegans［J］.Nature，2001，412(6842):90-94.

［8］ Francavilla A，Hagiya M，Porter K A，et al.Augmenter of liver regeneration:its place in the universe of hepatic growth factors［J］.Hepatology，1994，20(3):747-757.

［9］ Hagiya M，Francavilla A，Polimeno L，et al.Cloning and sequence analysis of the rat augmenter of liver regeneration(ALR)gene:expression of biologically active recombinant ALR and demonstration of tissue distribution［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1994，91(17):8142-8146.

［10］Giorda R，Hagiya M，Seki T，et al.Analysis of the structure and expression of the augmenter of liver regeneration(ALR)gene［J］.Mol Med，1996，2(1):97-108.

［11］ LaBrecque D R，Pesch L A.Preparation and partial characterization of hepatic regenerative stimulator substance(SS)from rat liver［J］.J Physiol，1975，248(2):273-284.

［12］Yao Z Q，Yang W S，Zhang W B，et al.Human hepatic regenerative stimulator substance:partial purification and biological characterization of hepatic stimulator substance from human fetal liver cells［J］.Hepatology，1990，12(5):1144-1151.

［13］ Tian Z J，An W.ERK1/2 contributes negative regulation to STAT3 activity in HSS-transfected HepG2 cells［J］.Cell Res，2004，14(2):141-147.

［14］ Pawlowski R，Jura J.ALR and liver regeneration［J］.Mol Cell Biochem，2006，288(1-2):159-169.

［15］Gandhi C R，Chaillet J R，Nalesnik M A，et al.Liverspecific deletion of augmenter of liver regeneration accelerates development of steatohepatitis and hepatocellular carcinoma in mice［J］.Gastroenterology，2015，148(2):379-391.

［16］ Wu Y，Zhang J，Dong L，et al.Hepatic stimulator substance mitigates hepatic cell injury through suppression of the mitochondrial permeability transition［J］.FEBS J，2010，277(5):1297-1309.