基于厚朴酚对白色念珠菌黏附性及其生物膜形成的影响探讨其抗龋作用

向晓波 周艳萌 冯琳颖 董 华

(1.遵义医学院附属口腔医院口腔外科，贵州遵义563000;2.遵义医学院微生物与免疫学实验室，贵州遵义563000;3.遵义医学院医学与科技学院2011级，贵州遵义563000;4.遵义医学院医学与科技学院2012级，贵州遵义563000)

龋病(dental caries)俗称虫牙、蛀牙，是多种因素作用下由口腔常驻菌引起的内源性感染性疾病，其特点是发病率高、分布广，是口腔常见疾病，也是人类最普遍的疾病之一。世界卫生组织已将其与肿瘤和心血管疾病并列为人类三大重点防治疾病。龋洞中的微生物都是以牙菌斑生物膜的形式定植在龋洞中［1］，在龋洞中存在一定数量的真菌，其中白色念珠菌(C.albicas)占优势［2］。在健康成年人龋洞中白色念珠菌被检出 50% ～60%［3］，有报道［4］高龋儿童的白色念珠菌检出率高于无龋儿童，在儿童牙本质龋中白色念珠菌的检出率占71% ～97%［5］，中老年人龋洞中的白色念珠菌检出率也很高［6］。同时，白色念珠菌也是在根管治疗中检出率最高的真菌［7］。

近些年来，研究［8］发现中药在治疗真菌生物膜方面具有较好的疗效，很少出现耐药，其具有药效长，不良作用小，能够调节菌群平衡等优点。中药厚朴为木兰科木兰属植物厚朴或凹叶厚朴的干燥干皮、根皮及枝皮。现代药理试验［9］证明厚朴具有广谱抗菌、抗肿瘤、抗炎、保护心脑血管、抗溃疡以及抗凝血等作用。厚朴酚(magnolol)及和厚朴酚(honokiol)是公认的厚朴基本活性成分，田玉珠等［8］观察了和厚朴酚对体外白色念珠菌生物膜形成的影响，发现其对白色念珠菌黏附及其生物膜的形成及厚度均有抑制。厚朴酚与和厚朴酚同属酚类，笔者推测其对白色念珠菌也应具有抑制作用，因此本试验拟通过微孔板法复制白色念珠菌体外黏附及生物膜模型，采用XTT〔2，3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide〕减低法初步探讨厚朴酚对白色念珠菌黏附、生物膜形成的影响，为厚朴酚用于口腔治疗白色念珠菌相关龋病提供基础实验依据。

1 材料与方法

1.1 菌种

白色念珠菌标准株ATCC 10231由遵义医学院微免实验室提供。

1.2 药物

厚朴酚购于上海圻明生物科技有限公司(HPLC法，纯度≥98%)。

1.3 试剂

RPMI 1640培养基(Gibco公司，美国)，YPD液体培养基依据文献［10］配制。XTT〔2，3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide〕购于加拿大BBI公司，二甲基亚砜(DMSO)(天津市光复精细化工研究所，分析纯)。

1.4 仪器

96孔微量培养板(Corning公司，美国)，DHP-9162型电热恒温培养箱 (上海一恒科技有限公司 )。MK3酶标仪(Thermo公司，美国)。

1.5 方法

1)C.albicas菌悬液的制备:冻存的菌株接种于沙氏培养基复苏、分离纯化，挑取单个菌落转种于酵母蛋白胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose medium，YPD)液体培养基中，30℃摇床培养过夜。PBS缓释液清洗3次后，用RPMI 1640培养基进行稀释，麦氏比浊管调整菌液浓度至1×106个细胞/mL。

2)厚朴酚应用液的配制:用40%聚乙二醇400将厚朴酚配成1 mg/mL的母液，滤器过滤除菌后，用RPMI 1640培养液按二倍稀释法将厚朴酚母液稀释成以下浓度:125、62.5 31.3、15.6 和7.8 mg/L。

3)不同浓度厚朴酚抗白色念珠菌黏附作用的测定:将100 μL的菌液(1×106cells/mL)接种于96 孔板中，37℃分别培养1、2和3 h，吸弃培养基，PBS洗去未黏附菌，加入上述各浓度药液100 μL，设阴性对照孔(仅含菌液)，每组设8个复孔，37℃培养24 h［9］，XTT 法检测 490 nm 的吸光度值(A 值)，重复 3次，取平均值。

4)不同浓度厚朴酚抗24 h白色念珠菌生物膜的测定:将100 μL浓度为1×106cells/mL的菌液加入96孔板第2～10孔，第11孔加入RPMI 1640培养液100 μL，37 ℃分别培养24 h，弃去培养基及浮菌，用PBS冲洗3次，第2～9孔加入上述各浓度药液100 μL，每个浓度均设8个复孔，第10～11孔各加RPMI 1640培养液100 μL，第10孔为阴性对照孔、11孔为空白对照孔。继续培养24 h。取XTT/PMS应用液100 μL加到已形成生物膜的培养孔中，继续37℃避光培养2 h［9］。在酶标仪波长490 nm处检测各孔吸光度(A值)。实验重复3次，计算抑菌率。按以下公式计算抑制率:抑制率=(阴性对照孔A值-实验组A值)/(阴性对照孔 A值-空白对照孔 A值)×100%［11］。

1.6 统计学方法

全部数据采用SPSS 17.0统计软件处理。计量资料用均数±标准差(±s)表示，并进行单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度厚朴酚抗白色念珠菌黏附作用

厚朴酚对白色念珠菌的黏附具有抑制作用，在同一时间点其作用具有浓度依赖性，125 mg/L及62.5 mg/L两个浓度组其抑制作用具有时间依赖性，见表1及图1。除2 h 7.8 mg/L浓度组，其余各实验组与阴性对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 不同浓度厚朴酚对白色念珠菌生物被膜形成的影响

厚朴酚对白色念珠菌形成的生物膜具有抑制作用，其作用具有浓度依赖性，125 mg/L及62.5 mg/L两个浓度组与阴性对照组相比差异具有统计学意义(P＜0.05)，详见表2。

表1 不同浓度厚朴酚1、2、3 h对白色念珠菌黏附作用的抑制情况Tab.1 Different concentrations of magnolol inhibition effect on C.albicas adhesion (n=8)

图1 不同浓度厚朴酚1、2、3 h对白色念珠菌黏附作用的抑制情况Fig.1 Different concentrations of magnolol inhibition effect on C.albicas adhesion(1 h，2 h，3 h)

表2 不同浓度厚朴酚对白色念珠菌生物被膜形成的抑制情况Tab.2 Different concentrations of magnolol inhibition effect on C.albicas biofilm formation (n=8)

3 讨论

牙菌斑生物膜是龋病发生的始动因子，龋病在本质上是菌群生态失衡性疾病。大多数微生物黏附在任何有生命或无生命的物体上，都是以生物膜的形式存在的。在牙菌斑中，变形链球菌、血链球菌、黏性放线菌、内氏放线菌、乳酸杆菌均为口腔天然常驻菌，与龋病发生关系密切。但是在龋洞中也存在一定数量的真菌，其中白色念珠菌(C.albicas)占优势［2］。白色念珠菌是临床最常见的条件致病真菌，调查结果显示念珠菌感染占真菌感染的73.4% ，其中白色念珠菌感染最为常见［12］。生物膜的形成经历黏附、微菌落形成、微菌落融合、生物膜形成与生物膜成熟等阶段，其中黏附是生物膜形成的第一步，至关重要，故抑制黏附是抗白色念珠菌生物膜感染的关键措施［13-15］。冯瑾等［16］研究发现厚朴酚对主要致龋的变异链球菌、血链球菌、内氏放线菌、黏性放线菌及乳酸杆菌等5种细菌具有抑制作用，并能减少菌斑生物膜中致病菌的数量。但目前无厚朴酚针对菌斑中白色念珠菌作用的相关研究。本试验采用微孔板法观察不同浓度的厚朴酚对白色念珠菌黏附的影响，发现62.5 mg/L和125 mg/L厚朴酚可以显著的抑制白色念珠菌的黏附，其抑制作用具有时间及浓度依赖性，与阴性对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.05)。采用微孔板法复制体外生物膜模型，观察不同浓度的厚朴酚对白色念珠菌生物膜的影响，发现实验所选5个浓度的厚朴酚对白色念珠菌的生物膜均有不同程度的抑制作用，其中125 mg/L厚朴酚对其抑制率达到66.32%。黏附是白色念珠菌发挥致病性的一个重要因素，厚朴酚可有效抑制白色念珠菌的黏附，当生物膜形成后，厚朴酚又能有效抑制生物膜形成。笔者推测厚朴酚可通过抑制白色念珠菌的黏附而有效降低其致病性，并对已形成的生物膜具有明显的抑制作用，但厚朴酚抗白色念珠菌确切的作用机制还有待进一步研究。

综上，厚朴酚能抑制白色念珠菌的黏附及生物膜的形成，提示其作为抗龋药物有良好的应用前景。

［1］ 张欣然，刘新.细菌生物膜与龋齿相关性的研究进展［J］.中国微生态学杂志，2011，23(5):479-480.

［2］ 仵楠，赵今.白色念珠菌与主要致龋菌相关性研究［J］.口腔医学研究，2012，28(10):1080-1082.

［3］ Thein Z M，Samaranayake Y H，Samaranayake L P.Effect of oral bacteria on growth and survival of Candida albicans biofilms［J］.Arch Oral Biol，2006，51(8):672-680.

［4］ Ollila P S，Larmas M A.Long-term predictive value of salivary microbial diagnostic tests in children［J］.Eur Arch Paediatr Dent，2008，9(1):25-30.

［5］ de Carvalho F G，Silva D S，Hebling J，et.al.Presence of mutans streptococci and Candida spp.in dental plaque/dentine of carious teeth and early childhood caries［J］.Arch Oral Biol，2006，51(11):1024-1028.

［6］ Zaremba M L，Daniluk T，Rozkiewicz D，et al.Incidence rate of Candida species in the oral cavity of middle-aged and elderly subjects［J］.Adv Med Sci，2006，51(Suppl 1):233-236.

［7］ 许颖，莫文静，付爽，等.鱼腥草素钠对白色念珠菌磷脂酶体外作用的研究［J］.口腔医学研究，2014，30(5):396-399.

［8］ 田玉珠，王健平，杨景云，等.和厚朴酚对根管内白色念珠菌生物膜作用的体外研究［J］.中国微生态学杂志，2013，25(2):154-156.

［9］ 殷帅文，何旭梅，郎锋祥，等.厚朴化学成分和药理作用研究概况［J］.贵州农业科学，2007，35(6):133-135.

［10］钟罗枫，王文丽，陈慧芝，等.紫檀茂对白色念珠菌生物膜的体外抑制作用［J］.广东药学院学报，2013，29(3):305-309.

［11］许颖，莫文静，付爽，等.鱼腥草素钠对白色念珠菌磷脂酶体外作用的研究［J］.口腔医学研究，2014，30(5):396-399.

［12］赵兰雪，李德东，王彦，等.抗白念珠菌生物被膜药物的研究进展［J］.中国真菌学杂志，2013，8(2):124-128.

［13］汪天明，严园园，施高翔，等.黄连解毒汤乙酸乙酯提取物对白假丝酵母菌黏附作用的影响［J］.中国微生态学杂志，2014，26(4):391-396.

［14］丁秀荣，苏建荣.氟康唑对近平滑念珠菌生物膜的影响［J］.首都医科大学学报，2014，35(4):433-437.

［15］曾昭瑛，苏建荣.抗念珠菌药物的耐药特性分析［J］.首都医科大学学报，2012，33(2):169-176.

［16］冯瑾，李继遥，周学东.厚朴活性成分对致龋菌生长和产酸影响的体外研究［J］.四川大学学报:医学版，2007，38(3):456-458.