恩施州内外环境硒水平与慢性乙肝患者外周血淋巴细胞亚群改变的研究

朱旻玥，向艳丽，周晓玲，龙波霖，王凤杰，陈显兵*

1．湖北民族学院医学院(湖北恩施445000)

2．恩施自治州中心血站(湖北恩施445000)

3．恩施自治州中心医院(湖北恩施445000)

病毒性肝炎在全世界广泛传播，严重危害人类健康，是一种常见病，多发病。以肝细胞损伤为主要特征，但其损伤机制迄今尚未完全阐明。目前认为HBV不直接杀伤细胞，但是细胞免疫和体液免疫机制在乙型肝炎患者出现的病理性损伤中起主要作用。研究发现硒是人体必需微量元素，谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)活性中心，具有消除自由基、调节淋巴细胞的增殖和分化，影响免疫应答的功能，与肝脏疾病的发生、发展及预后关系密切［1］。作者调查了湖北省恩施土家族苗族自治州天然高硒区、富硒区、低硒区正常人群及慢性乙型肝炎患者内、外环境硒水平及外周血淋巴细胞亚群改变情况，分析内外环境硒水平与免疫功能之间的关系，为今后病毒性肝炎基于免疫治疗提供依据。

1 材料与方法

1．1 调查对象与分组 根据要求在湖北省恩施土家族苗族自治州高硒区:恩施市新塘、鱼塘坝选择了20例慢性乙型肝炎患者，男11例，女9例，平均年龄(34．0±13．9)岁;富硒区:恩施市芭蕉、自生桥选择了22例慢性乙型肝炎患者，男10例，女12例，平均年龄(36．0±14．3)岁;低硒区:利川市民生、建南选择了25例慢性乙型肝炎患者，男13例，女12例，平均年龄(35．0±12．1)岁。在上述三个地区分别选择20例正常人作为对照组，排除心、肺及免疫系统等重大疾病，血清乙肝病原检测阴性。所有慢性乙型肝炎患者根据HBV血清病原学检测、临床表现及实验室检查，诊断符合2005年慢性肝炎诊断标准［2］，且3年内没有经过药物治疗。慢性肝炎患者与正常对照组之间性别、年龄等一般情况比较无明显差异(P＞0．05)。同时分别在高硒区、富硒区及低硒区采集可耕地距地表10 cm以下土壤各15份，每份200 g，除去杂质，晾干磨细后待测;采集大米、茶叶15份，每份均为200g，去离子水洗涤，晾干后，研磨成细粉待测。

1．2 测定方法

1．2．1 样品采集 按照知情同意的原则采集慢性乙型肝炎患者及正常对照人群外周静脉血5 mL分成2份，EDTA抗凝，先吸取2 mL全血用于硒的测定。余下3mL血液标本加入淋巴细胞分离液3mL，离心(1500 r/min，15 min)，提取淋巴细胞层，以PBS 2 mL漂洗，再用同样方法离心两次，去上清液用于荧光标记的单克隆抗体试剂盒计数外周血CD3+/CD4+/CD8+淋巴细胞数量。

1．2．2 测定方法 土壤、大米、茶叶和血的含硒量采用氢化物发生原子荧光法测定［3］。用流式细胞仪(美国BD公司)及配套的荧光标记的单克隆抗体试剂盒计数外周血CD3+/CD4+/CD8+淋巴细胞数量。鼠抗人CD3、CD4单克隆抗体(美国NEOMARKERS公司1∶10);鼠抗人CD8单克隆抗体(美国NEOMARKERS公司，1 ∶25)。

2 结果

2．1 各地区之间土壤、大米和茶叶含硒量 高硒区土壤、大米含硒量高于富硒区和低硒区含硒量，差异有统计学意义(F 值分别为 422．7、470．9，156．1，P＜0.01)。茶叶含硒量高硒区和富硒均高于低硒区(P＜0．05)，高硒区与富硒区之间无显著差别。见表1。

表1 高硒区、富硒区、低硒区土壤、大米和茶叶含硒量检测结果(n=15 ±s)mg/kg

表1 高硒区、富硒区、低硒区土壤、大米和茶叶含硒量检测结果(n=15 ±s)mg/kg

注:*P＜0．01，compared with low selenium area;△P＜0．05 compared with rich-selenium area。

地区 土壤含硒量 大米含硒量 茶叶含硒量高硒区 7．73±0．66＊△ 2．96±0．26＊△ 1．58±0．29*富硒区 4．76±0．92* 2．36±0．37* 1．54±0．34*低硒区 0．71±0．20 0．14±0．08 0．11±0．05

2．2 血硒水平 高硒区、富硒区、低硒区健康对照组血硒水平均高于同地区病例组，具有显著差异(t值分别为 8．385、7．570、6．075，P＜0．01)。健康对照组血硒水平与低硒区比较差异有统计学意义(F=17．991，P＜0．01)，高硒区和富硒区之间差别不明显。乙肝病例组血硒水平与低硒区比较差异有统计学意义(F=10．08，P＜0．01)，高硒区和富硒区之间无差别。见表2。

表2 高硒区、富硒区、低硒区乙肝患者及对照人群血硒量检测结果()μg/L

表2 高硒区、富硒区、低硒区乙肝患者及对照人群血硒量检测结果()μg/L

注:*P＜0．01compared with hepatitis B patients group;△P＜0．05 compared with low selenium area

组别 高硒区 富硒区 低硒区例数 血硒含量 例数 血硒含量 例数 血硒含量对照组 20 194．5±50．9＊△ 20 182．7±43．6＊△ 20 112．6±38．4*乙肝组 20 84．1±29．6△ 22 91．5±34．3△ 25 54．8±25．2

2．3 外周血淋巴细胞亚群检测结果 高硒区、富硒区、低硒区对照组淋巴细胞亚群CD3、CD4、CD8及CD4/CD8之间差异不显著(P＞0．05)。富硒区慢性乙肝患者淋巴细胞亚群CD3、CD4、CD8均比正常对照组呈现下降的趋势，但显著性不明显。高硒区和低硒区淋巴细胞亚群(CD3、CD4、CD8)与慢性乙肝组比较具有显著差异(t值分别为 5．821、5．017、2．849;6．603、5．324、3．594，P＜0．05)。富硒区慢性乙肝患者淋巴细胞亚群数量高于高硒区和低硒区(F 值分别为 14．04、10．32、8．29，P＜0．01)。

表3 外周血CD3+/CD4+/CD8+淋巴细胞检测结果(个/μl)

3 讨论

病毒性肝炎的发病机制非常复杂，自由基及其引发的脂质过氧化反应也是其分子病理学基础之一。临床流行病学研究表明，各型肝病患者均不同程度缺硒或血硒水平低下，并与病情相关［3］。研究发现硒缺乏时，T细胞在免疫反应中的克隆放大作用有不良影响。补充一定剂量的硒可使人及动物的Tc细胞和NK细胞活性明显增强。硒能促进淋巴细胞分泌淋巴因子，特别是IL-2的分泌能力提高。同时硒对体液免疫有一定的激活作用，它可以提高机体合成IgG、IgM等抗体的能力［4］。在病毒复制过程中，硒的需要量增加导致硒缺乏并产生毒害宿主细胞的氧自由基。硒缺乏导致病毒基因组的氧化性损害，诱导增加病毒致病性的突变。补硒可预防某些病毒的复制，还可能预防或调节病毒性疾病的病程［5］。其具体的功能表现在以下3个方面:①调节淋巴细胞的增殖和分化，保护细胞膜和免疫细胞骨架结构不受氧化损伤。②促进淋巴细胞分泌淋巴因子，影响免疫应答水平③激活淋巴细胞酶系活性，增强淋巴细胞的细胞毒作用［6］。同时有学者研究发现反转录病毒含有编码硒蛋白的UGA密码子，提示硒与病毒复制有关［7］。

本实验观察到高硒区、富硒区的土壤、大米、茶叶的含硒量均明显高于低硒区，结果与文献报道相一致［8-9］。通过检测血硒，可以发现高硒区、富硒区、低硒区健康对照组血硒水平均高于同地区乙肝病例组(P＜0．01)，慢性肝炎患者血硒含量明显减少。同时发现乙肝病例组中血硒水平与外环境硒水平密切相关。慢性乙肝患者血硒水平的降低程度受外环境的影响较小而与HBV的感染及病变程度有一定关系，与以往的报到结果一致［3］。有研究发现，在慢性肝炎患者中，可能有较多的CD3、CD4、CD8细胞向肝脏迁徙，从而较多地浸润到肝组织中，通过分泌干扰素-γ等促炎因子而引起肝组织的损害［10］。实验发现慢性肝炎患者的外周血 CD3、CD4、CD8细胞计数较正常组显著下降，可能与CD3、CD4、CD8细胞向肝脏迁徙有一定关系。同时发现在一定范围内外环境硒水平和血硒水平越高，外周血淋巴细胞亚群改变越小，提示外、内环境硒水平与外周血淋巴细胞亚群的数量成负相关(相关系数分别为 r=-0．872、r=-0．9270，P＜0．01)。

由于硒元素在生命活动中的巨大作用，以及世界上包括中国在内的众多国家动物、植物缺硒状况的存在，本研究将为恩施富硒地区开发富硒生物资源提供广阔的市场，同时也为硒元素对病毒性肝炎的防止提供参考。

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