吡哆胺和替米沙坦对自发性高血压大鼠心肌重塑相关指标的影响

郑炜平，朱鹏立，李峰，余惠珍，林帆，林虹，林开阳

吡哆胺和替米沙坦对自发性高血压大鼠心肌重塑相关指标的影响

郑炜平，朱鹏立，李峰，余惠珍，林帆，林虹，林开阳

目的: 观察单用及联用吡哆胺和替米沙坦对自发性高血压大鼠（SHR）心肌重塑相关指标的影响。

方法: 48只22周龄雄性SHR，随机分为4组，12只/组。高血压对照组（H组）予以蒸馏水2 ml/d、替米沙坦组（T组）予以替米沙坦6 mg/ （kg·d）、吡哆胺组（P组）予以吡哆胺200 mg/ （kg·d）、联合干预组（TP组）予以替米沙坦6 mg/ （kg·d）+吡哆胺200 mg/ （kg·d）灌胃。测定干预前后大鼠尾动脉收缩压。干预16 W后，化学发光法检测血清一氧化氮（NO）、超氧化物歧化酶（SOD），酶联免疫吸附测定法检测血清晚期糖基化终末产物（AGEs），计算左心室重量指数，计算心肌胶原容积分数，实时定量聚合酶链式反应（PCR）检测心肌晚期糖基化终末产物受体（RAGE）信使核糖核酸（mRNA）表达水平。

结果: 与H组相比，T组、TP组收缩压下降（P ＜0.01），P组收缩压无明显改变（P＞0.05 ）；与H组相比，T组、P组、TP组血清NO、SOD浓度升高（P ＜0.01）；与T组、P组相比，TP组血清NO浓度、SOD浓度进一步升高（P ＜0.05）。与H组相比，T组、P组、TP组左心室重量指数、心肌胶原容积分数降低（P ＜0.01）；与T组、P组相比，TP组左心室重量指数、心肌胶原容积分数进一步降低（P＜0.05）。与H组（6.71±0.50） mg/L相比，T组（5.99±0.51） mg/L、P组（5.57±0.91）mg/L、TP组（5.24±0.63） mg/L血清AGEs降低（P ＜0.01）；与T组、P组相比,TP组血清AGEs进一步降低（P＜0.05）。吡哆胺和替米沙坦两因素在左心室重量指数、心肌胶原容积分数中存在协同效应 （P ＜0.05）。与H组（0.053±0.010）相比,T组（0.035±0.010）、P组（0.036±0.005）、TP组（0.024±0.007）RAGE mRNA表达水平降低（P ＜0.01）；与T组、P组相比,TP组RAGE mRNA表达水平进一步降低（P ＜0.05）。差异均有统计学意义。

结论：吡哆胺有独立于降压因素之外的改善SHR体内氧化应激状态、改善心肌重塑相关指标的作用，联用吡哆胺和替米沙坦可以从不同途径打破氧化应激介导的AGEs-RAGE和肾素—血管紧张素系统的协同作用，进一步改善心肌重塑相关指标。

晚期糖基化终末产物； 吡哆胺； 替米沙坦； 自发性高血压大鼠

Methods: A total of 48 male SHR at 22 weeks of age were randomly divided into 4 groups: ①Hypertension （H）control group, the rats received distilled water 2 ml/d,②telmisartan （T） group, the rats received telmisartan 6 mg/（kg.d）,③pyridoxamine （P） group, the rats received pyridoxamine 200 mg/（kg.d）, ④Combination （TP） group, the rats received both telmisartan and pyridoxamine. All animals were treated for 16 weeks and the systolic blood pressure （SBP） was measured before and after treatment. After treatment, the serum levels of nitric oxide （NO） and super oxide dismutase （SOD） were examined by chemiluminescent method, advanced glycation end-products （AGEs） was detected by ELISA, left ventricular weight index and collagen volume fraction （CVF） in myocardial tissue were calculated, the mRNA expression of myocardial

receptor of advanced glycation end products （RAGE） was evaluated by real time RT-PCR.

Results: Compared with H group, SBP levels were decreased in T and TP groups, P＜0.01, while SBP in P group stayed similar, P＞0.05. Compared with H group, the serum levels of NO and SOD were increased in T, P and TP groups, P＜0.01; while compared with T group and P group, the levels of NO and SOD were further increased in TP group, P＜0.05. Compared with H group, left ventricular weight index and CVF were decreased in T, P and TP groups, P＜0.01; while compared with T group and P group, left ventricular weight index and CVF were further decreased in TP group, P＜0.05. Pyridoxamine and telmisartan had the coordinative effect on left ventricular weight index and CVF, P＜0.05. The serum levels of AGEs were lower in T group （5.99 ± 0.51） mg/L, P group （5.57 ± 0.91） mg/L and TP group （5.24 ± 0.63） mg/L than that in H group, （6.71 ± 0.50） mg/L, P＜0.01; while compared with T group and P group, AGEs was further decreased in TP group, P＜0.05. The mRNA expressions of RAGE were reduced in T group （0.035 ± 0.010）, P group （0.036 ± 0.005） and TP group （0.024 ± 0.007）than that in H group （0.053 ± 0.010）, P ＜0.01; while compared with T group and P group, the mRNA of RAGE was further reduced in TP group, P＜0.05.

Conclusion: Pyridoxamine could improve the oxidative stress and the indexes of myocardial remodeling independently from decreasing blood pressure in SHR. Combined intervention of P and T may break the coordination systems between AGEs-RAGE and renin-angiotensin, therefore further improve the indexes of myocardial remodeling in SHR.

（Chinese Circulation Journal, 2015,30:689.）

胰岛素抵抗是高血压重要的发病机制之一。胰岛素抵抗导致体内晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs）水平增高[1]。高血压患者体内AGEs水平明显高于正常人[2]。AGEs是体内葡萄糖通过非酶性糖基化反应（Maillard反应）与蛋白质、脂肪酸或核酸交联而成的一大类稳定的有生物学活性的聚合物，其主要受体为晚期糖化终末产物受体（receptor of advanced glycation end products，RAGE）[3]。高血压病心肌重塑是心力衰竭、心律失常、猝死等并发症的病理生理基础。本研究通过吡哆胺、替米沙坦干预自发性高血压大鼠（SHR），检测干预组与对照组血清一氧化氮（NO）、超氧化物歧化酶（SOD）、AGEs水平，心肌显微形态、左心室重量指数、心肌胶原分数及心肌RAGE信使核糖核酸（mRNA）表达水平，了解吡哆胺、替米沙坦对SHR心肌重塑相关指标的影响，探讨其可能机制。

1 材料与方法

实验时间：2009-01至2011-01。实验动物：48只SPF级别SHR大鼠（雄性，22周龄）购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（沪）2007-0005，饲养于福建医科大学实验动物中心SPF屏障系统， 许可证号：SYXK（闽）2008-0001。

主要试剂和仪器：替米沙坦（德国勃林格殷格翰公司，批号807856），吡哆胺（美国BIOFER公司 批号：09549 CAS-NO）。AGEs 酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（美国R&D）。SOD试剂盒、NO试剂盒（南京建成生物工程研究所）。总核糖核酸（RNA）抽提试剂盒（上海飞捷生物技术有限公司）、逆转录试剂盒（美国Fermentas公司）、实时定量聚合酶链式反应（PCR）试剂盒（广州东盛生物科技有限公司）。TakaRa TP 800型实时荧光定量PCR仪（日本TaKaRa 公司）。大鼠尾动脉收缩压无创血压计（BP-98AL，日本Softron）。

分组与干预：48只SHR随机分为高血压对照组（H组）、替米沙坦组（T组）、吡哆胺组（P组）、联合干预组（TP组），每组12只。H组予蒸馏水2 ml/d 灌胃，T组予替米沙坦6 mg/ （kg·d）灌胃，P组予吡哆胺200 mg/ （kg·d）灌胃，TP组予替米沙坦6 mg/ （kg·d）+吡哆胺200 mg/ （kg·d）灌胃。各组大鼠干预时间16 W。每两周于同一时间点检测大鼠尾动脉收缩压直至实验结束。

血液标本采集及测定：干预16 W后，麻醉SHR，腹主动脉采动脉血5 ml，离心后4℃保存，待测NO、SOD；-80℃保存，待测AGEs。血清NO采用硝酸还原法、血清SOD采用超微量快速测定法、血清AGEs采用竞争性ELISA法检测。操作均严格按说明书要求进行。

左心室重量指数计算：电子计量秤称取大鼠体重，麻醉后，解剖剥离双侧心房和右心室，滤纸吸干后称取左心室重量，将左心室重量（mg）除以体重（g），即为左心室重量指数（mg/g）。

心肌胶原容积分数测定：各组切片用医学图像分析系统（IPPS）进行半定量分析，400倍高倍镜下随机取4个视野，并通过灰度调节区别胶原与非胶原成分。测量心室心肌胶原面积和统计场总面积，心肌胶原容积分数=心室心肌胶原面积/统计场总面积×100%。

心肌显微形态学观察：取心室乳头肌处心肌标本，厚度约5 mm，经固定、包埋、切片、展片、干燥后，以苦味酸—天狼星红染液中浸染、苏木素伊红复染、无水酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。在400倍光学显微镜下观察各实验组SHR心脏切片心肌细胞排列情况，细胞大小、形态、胶原纤维增生情况。

心肌RAGE mRNA表达水平测定：取心室乳头肌处心肌标本， Real-time PCR检测RAGE mRNA表达水平。按TRIzol说明书提取总RNA，进行逆转录和PCR反应，引物序列为5'-CTCCTGTCAACATCAGGGTCAC-3'和5'-GATCCCTAAGGCCAGGGCTA-3'，由大连宝生物公司设计与合成。样品与标准品同时在TaKaRa Code TP800进行分析处理，分别对目的基因和内参基因标准品做2条标准曲线。得到内参基因Ct值与目的基因Ct值经相应基因标准曲线进行换算，得出各自的起始模板量（校正值＝目的基因始模板量/内参基因始模板量）。

2 结果

一般结果： T组、TP组各有2只SHR因打斗、麻醉意外死亡，共44只SHR完成实验。计量数据经统计学检验符合正态、等方差。

各实验组大鼠收缩压变化情况：与H组收缩压[（199.67±13.07）mmHg，1 mmHg=0.133 kPa]相比T组[（133.00±15.55）mmHg]、TP组[（131.30±14.25）mmHg] 收缩压明显下降（P＜0.01），P组收缩压[（198.30±13.36）mmHg]无明显改变（P ＞0.05 ）；T组与TP组相比收缩压差异无统计学意义（P ＞0.05 ）。

各实验组大鼠NO、SOD、AGEs、左心室重量指数、胶原容积分数检测值比较（表1）：与H组相比，T组、P组、TP组血清NO、SOD浓度升高，差异有统计学意 义（P＜0.01）；与T组、P组相比，TP组血清NO浓度、SOD浓度进一步升高（P＜0.05）。与H组相比，T组、P组、TP组AGEs、左心室重量指数、心肌胶原容积分数均降低（P＜0.01）；与T组、P组相比，TP组AGEs、左心室重量指数、心肌胶原容积分数进一步降低，差异有统计学意 义（P＜0.05）。

表1 各实验组大鼠一氧化氮、超氧化物岐化酶、晚期糖基化终末产物、左心室重量指数、胶原容积分数检测值比较

表1 各实验组大鼠一氧化氮、超氧化物岐化酶、晚期糖基化终末产物、左心室重量指数、胶原容积分数检测值比较

注：H组：高血压对照组，T组：替米沙坦组，P组：吡哆胺组，TP组：联合干预组。与H组相比*P＜0.01；与T组相比△P＜0.05；与P组相比▲P＜0.05

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替米沙坦、吡哆胺干预对左心室重量指数、心肌胶原容积分数影响的双因素方差分析（表2、表3）：对T组、P组、TP组血清NO、SOD、血清AGEs、左心室重量指数、心肌胶原容积分数以是否加用替米沙坦和吡哆胺两个因素进行双因素方差分析，发现这两个因素在左心室重量指数、心肌胶原容积分数中存在协同效应（P＜0.05），差异均有统计学意义。

表2 替米沙坦、吡哆胺干预对左心室重量指数影响的双因素方差分析

表3 替米沙坦、吡哆胺干预对心肌胶原容积分数影响的双因素方差分析

各实验组大鼠心肌显微形态学观察（图1）：H组较T组、P组、TP组心肌细胞排列紊乱，细胞增生、肥大，细胞外胶原纤维增生增多。

各实验组大鼠RAGE mRNA的RT-PCR相对定量比较：与H组（0.053±0.010）相比，T组（0.035±0.010）、P组（0.036±0.005）、TP组（0.024±0.007）RAGE mRNA表达水平均降低（P＜0.05）；与T组、P组相比TP组RAGE mRNA表达水平进一步降低（P＜0.05）。差异均有统计学意义。

图1 各实验组大鼠心肌苦味酸—天狼星红染色结果（×400）

3 讨论

高血压病的发生、发展过程也是其靶器官进行性损害的过程。心脏是高血压病的重要靶器官之一，心肌重塑是一个渐进的过程，早期心肌重塑对血液动力学负荷可适应性代偿，但到后期，进展到心室肥厚，导致心脏收缩和舒张功能障碍，则成为心力衰竭发生、发展的基础。心肌重塑表现为心脏重量增加，心肌体重指数升高、左心室肥厚、左心室容积增大等。组织变化特征为心肌细胞肥大、排列紊乱、Ⅰ/Ⅲ型胶原纤维比例增高[4]。

AGEs可通过修饰心肌胶原蛋白使其交联增加、不易降解，引起心肌重塑。Candido等[5]的研究表明存在胰岛素抵抗的大鼠心脏AGEs修饰的胶原明显增加，胶原可溶性降低，胶原交联增加，Ⅰ/Ⅲ型胶原纤维比例增高， 左心室重量指数增加，上述情况可以被AGEs阻滞剂ALT-711改善。AGEs可以灭活体内抗氧化物质NO、SOD，促进活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）集聚，加重体内氧化应激状态[6]，氧化应激是心肌重塑的重要机制之一。AGEs与RAGE结合可激活纤维性细胞因子、结缔组织生长因子和转化生长因子β1导致心肌纤维化，引起心肌重塑[7]。hhlim基因是与心脏生长发育有关的基因，可以促进心肌细胞增生、肥大，主要在心肌细胞中表达[8]，在心肌肥厚大鼠的心肌细胞中hhlim基因表达活性增强[9]。邵亚辉等[10]的研究发现用AGEs刺激乳鼠心肌细胞可导致hhlim基因蛋白的表达增加， 说明AGEs通过其受体RAGE介导参与心肌肥厚和左心室重塑。

吡哆胺是一种自由基清除剂， 可能通过抑制氧化应激而减少AGEs的形成[11]。羰基化合物能明显加速AGEs的形成，吡哆胺作为亲核化合物可清除羰基化合物，是吡哆胺抑制AGEs形成的一种可能机制[5]。目前已有多个独立研究证实吡哆胺能强力抑制体外及体内AGEs的产生[12，13]。本研究也发现吡哆胺干预后SHR血压无明显下降，但血清NO、SOD水平明显升高、AGEs明显下降，左心室重量指数、心肌胶原容积分数指标改善，提示吡哆胺独立于降压因素之外的改善SHR大鼠心肌重塑的作用。

替米沙坦作为血管紧张素Ⅱ的1型（AT1）受体拮抗剂，其在高血压病中的降压、抗氧化应激及抑制心肌重塑的作用已为众多研究所证实。本研究提示联用替米沙坦、吡哆胺对降低SHR左心室重量指数、心肌胶原容积分数，改善心肌重塑有协同作用，可能与吡哆胺与替米沙坦可以从不同途径打破氧化应激介导的肾素—血管紧张素系统和AGEs-RAGE的协同作用有关。血管紧张素Ⅱ可以使氧化应激的关键酶尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶

（NADPH oxidase，NOX）被异常激活，产生过量活性氧簇[14]。对内皮细胞和血管平滑肌细胞的研究表明，血管紧张素Ⅱ可通过作用于NOX复合体多个亚基，增加该酶的活性，从而增加ROS的产生[15]。在心肌组织中，血管紧张素Ⅱ主要通过糜酶途径所产生，AGEs-RAGE可以通过氧化应激介导的ERK1/2通路使由糜酶途径所产生的血管紧张素Ⅱ增多。Koka等[16]的研究发现局部组织AGEs、细胞外调节蛋白激酶（ERK）、促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）随着糜蛋白酶的含量增高而增高。Sebeková等[17]的研究发现氧化应激状态下AGEs合成增多。AGEs与RAGE结合，通过к基因结合核因子（NF-кB）、蛋白激酶C （PKC）、或其他途径刺激多种细胞分泌细胞因子和生长因子，促进炎症反应和氧化应激过程，形成一个自我放大的恶性循环过程[18]。因此氧化应激既是AGEs-RAGE和肾素—血管紧张素系统对心血管的共同损伤机制又是AGEs-RAGE和肾素—血管紧张素系统相互协同作用的通路。

综上所述，吡哆胺有独立于降压因素之外的改善SHR体内氧化应激状态、改善心肌重塑相关指标的作用，联用吡哆胺和替米沙坦可以从不同途径打破氧化应激介导的AGEs-RAGE和肾素—血管紧张素系统的协同作用，进一步改善心肌重塑相关指标。

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Effect of Pyridoxamine and Telmisartan on the Indexes of Myocardial Remodeling in Spontaneous Hypertensive Rats

ZHENG Wei-ping, ZHU Peng-li, LI Feng, YU Hui-zhen, LIN Fan, LIN Hong, LIN Kai-yang.
Department of Geriatric Medicine, Fujian Provincial Hospital, Fujian Medical University, Fuzhou （350001）, Fujian, China

Objective: To observe the effect of pyridoxamine and telmisartan on the indexes of myocardial remodeling in spontaneous hypertensive rats （SHR）.

Advanced glycation end products; Pyridoxamine; Telmisartan; Spontaneous hypertensive rats

2014-12-14）

（编辑：漆利萍）

福建省自然科学基金（20l0J0ll27）

350001 福建省福州市，福建省立医院 老年科 福建医科大学省立临床医学院 福建省临床老年病研究所

郑炜平 副主任医师 硕士 主要从事心血管内科工作 Email：sycdxy66@163.com 通讯作者：朱鹏立 Email：zpl7755@126.com

R541

A

1000-3614（2015）07-0689-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.07.018