MiR-15a对奶牛乳腺上皮细胞泌乳功能的影响

邵丽，曲波，王春梅，李庆章，高学军，李慧铭，王褚悦，张莉

（东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨150030）

0 引言

MicroRNAs（miRNAs）是近年来发现的一类广泛存在于动植物细胞的内源性单链非编码RNA分子，它在调控基因转录与表达、细胞周期、细胞凋亡、机体生长发育等过程中发挥着重要的作用[1]。miRNAs可通过部分互补结合到靶基因mRNA的非编码区3′UTR从而阻碍其翻译来调控基因的表达[2]。miR-15a定位于人类染色体13q14[3]，其作为凋亡因子、癌基因、抑癌基因、抑制细胞周期蛋白表达等方面的作用都有相关的研究报道[4-7]。Li等[8]研究发现miR-15a可通过调控生长激素受体，影响奶牛乳腺上皮细胞泌乳通路蛋白的表达。总之，目前关于miR-15a对奶牛乳腺上皮细胞具体作用的研究还是很少。本实验通过在奶牛乳腺细胞中过表达bta-miR-15a，研究其对奶牛乳腺上皮细胞泌乳功能的具体影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物组织

本研究选取妊娠中期奶牛乳腺组织用于乳腺上皮细胞的培养，器具严格灭菌。准备含有100 U/mL青霉素和质量浓度为100 mg/L链霉素的经0.22 μm滤膜过滤D-Hank’s缓冲液。常规手术切取乳腺组织，迅速将乳腺组织切割成块约100 ng的小组织块，生理盐水冲洗几次后，将组织置于装有D-Hank’s缓冲液（含双抗、两性霉素）的三角瓶中，冰盒保存，马上带回实验，用于乳腺上皮细胞培养实验。

1.1.2 抗体与试剂

Cytokeratin（C-04）18 Antibody，鼠抗羊β-actin多克隆抗体，辣根酶标记山羊抗兔，山羊抗鼠IgG一抗，FITC-山羊抗兔IgG，山羊抗鼠二抗；bta-miR-15a mimics，Negative Control，转染试剂 LipofectamineTM2000，DMEM/F-12培养基，胎牛血清，DMSO，Opti-MEM I medium（Gibco），β-Casein 抗体，BCA蛋白浓度测定试剂盒，预染蛋白Marker（10～230ku）；PX型医用X-ray胶片，ECL超敏发光液，血液甘油三酯酶测定试剂盒，Lactose/D-Glucose Assay Kit试剂盒等。

1.1.3 主要仪器和设备

倒置相差显微镜DFC280，激光扫描共聚焦显微镜 TCS-SP2 AOBS，Mini Trans-Blot Criterion半干转印仪，Model 680型全自动酶标仪，DYY-5型稳压稳流电泳仪，DYCZ-23A型稳压电泳槽，PowerLook 2100XL扫描仪，ULT1386-3-V30型超低温冰箱，超纯水器，立式自动电热压力蒸汽灭菌器，CO-150 CO2培养箱等。

1.2 方法

1.2.1 奶牛乳腺上皮细胞的培养与鉴定

按Ke等[9-11]的方法进行奶牛乳腺上皮细胞的分离和原代培养。将所得的奶牛乳腺上皮细胞接种于培养瓶中，在37℃质量分数为5%的CO2的培养箱中培养。根据上皮细胞与成纤维细胞对酶敏感性不同将混合生长的原代或传代奶牛乳腺上皮细胞纯化。将纯化的奶牛乳腺上皮细胞接种到35 mm小皿中，质量分数4%多聚甲醛固定，质量分数5%的BSA封闭，细胞角蛋白18一抗，FITC-山羊抗兔IgG二抗免疫荧光染色，在激光共聚焦显微镜下观察细胞角蛋白18的特异性表达情况，参考文献[12]中的方法进行。

1.2.2 奶牛乳腺上皮细胞的瞬时转染

取对数生长期的奶牛乳腺上皮细胞，用完全培养基将其浓度调整为6.0×105mL-1，接种于六孔培养板中，37℃培养箱中孵育过夜待转染。用①Opti-MEM I medium稀释LipofectamineTM2000脂质体转染试剂（6孔培养板6 μL+94 μL），轻轻混匀，在室温孵育5 min；②将 miR-15a mimics、Negative Control分别用适量Opti-MEM I medium稀释（6孔细胞培养板8 μL+92 μL），柔和混匀室温孵育5 min。①＋②分别混匀，每组实验进行3次重复，形成的复合物在室温条件下孵育20 min，将复合物逐滴加入换有Opti-MEM I medium培养基的待转染细胞中；轻轻晃动细胞培养板以使细胞与复合物充分接触混合均匀，在37℃培养箱中进行培养，6 h后更换完全培养基，48 h后收集样品，备用。

实验具体分组如下：bta-miR-15a过表达组（bta-miR-15a mimics）；miR-15a阴性对照组（microRNA mimics NC）；加LipofectamineTM2000的空白对照组。

1.2.3 细胞分泌乳糖质量浓度的检测

转染方法和分组同1.2.2，每组3个平行，转染48 h后，收集6组细胞培养液，检测方法按照Lactose/D-Glucose(Rapid)Assay Kit试剂盒（Megazyme）说明书进行。在同等条件下进行乳糖含量的测定。

1.2.4 细胞分泌甘油三酯浓度的检测

转染方法和分组同1.2.2，每组3个平行，48 h后收集6组细胞培养液，检测方法按照血液甘油三酯酶法测定试剂盒（北京普利莱基因技术有限公司）说明书进行。

1.2.5 细胞β-酪蛋白表达量的检测

转染方法同1.2.2，分6组，每组3个平行，转染48h后，分别收获各组奶牛乳腺上皮细胞，用细胞裂解液提取细胞总蛋白，收集的细胞裂解液放入超声仪中震荡3次，每次10 s；再放入100℃水中煮沸5～10 min，12 000 r/min离心5 min，Manodrop2000测定蛋白浓度，2×SDS上样缓冲液调成相同浓度分装到200 μL小EP管中，置于-80℃冰箱中保存备用。进行SDS-PAGE凝胶电泳并转膜，转印后的NC膜37℃封闭2 h，一抗过夜，二抗1 h。在暗室中，加入ECL超敏化学发光液孵育压暗盒曝光，显影，定影。采用Image J2x软件对Western blotting图谱进行灰度扫描分析。

一抗为兔抗人β-Casein抗体、鼠抗羊β-actin多克隆抗体；二抗为辣根酶标记羊抗兔、羊抗鼠IgG，以β-actin为内参，进行光密度分析。

1.2.6 数据处理

使用SPSS16.0统计学软件进行数据的统计分析。本实验所有试验重复3次，数据两组之间比较采用t检验分析，三组数据比较则采用单因素方差分析，P＜0.05有统计学意义，定量数据以平均数±标准差表示。

2 结果

2.1 奶牛乳腺上皮细胞的培养与鉴定

图1为奶牛乳腺上皮细胞的培养与纯化。图1中，在倒置相差显微镜下观察纯化的奶牛乳腺上皮细胞，细胞排列紧密、形态均一，呈鹅卵石状（图1A）；图1B为成纤维细胞；图1C为乳腺上皮细胞与成纤维混合生长。图2为免疫荧光鉴定奶牛乳腺上皮细胞角蛋白18。图2中，圆形的是DAPI染色的细胞核，丝状绿色的是角蛋白18。由图2可以看出，本研究纯化后的细胞是奶牛乳腺上皮细胞。

图1 奶牛乳腺上皮细胞的培养与纯化

图2 奶牛乳腺上皮细胞的角蛋白18鉴定

2.2 细胞分泌乳糖质量浓度的影响

过表达miR-15a，转染48h后分别收集培养液，应用Lactose/D-Glucose(Rapid)Assay Kit试剂盒检验细胞培养液中的乳糖质量浓度。检测结果经统计分析后如表1所示。由表1可以看出，两个对照组之间乳糖的分泌量没有显著差异（P＞0.05），而在miR-15a基因过表达组中，奶牛乳腺上皮细胞所分泌的乳糖质量浓度要显著低于阴性对照组和空白对照组（P＜0.05），表明miR-15a可抑制奶牛乳腺上皮细胞乳糖的产生和分泌。

表1 奶牛乳腺上皮细胞中乳糖质量浓度的检测结果

2.3 细胞分泌甘油三酯浓度的变化

过表达miR-15a，转染48 h后分别收集培养液，应用甘油三脂测定试剂盒检测奶牛乳腺上皮细胞中的甘油三酯浓度，结果如表2所示。根据甘油三酯标准曲线（图3）分析比较试验结果显示，过表达miR-15a后，奶牛乳腺上皮细胞中的甘油三酯浓度显著减少（P＜0.05），表明miR-15a可抑制奶牛乳腺上皮细胞甘油三酯的产生和分泌。

图3 甘油三酯标准曲线

表2 奶牛乳腺上皮细胞中甘油三酯浓度的检测结果

2.4 细胞β-酪蛋白表达量的影响

用miR-15a mimics和negative control分别转染奶牛乳腺上皮细胞，转染48 h后，应用Western blotting方法检测奶牛乳腺上皮细胞β-酪蛋白的表达变化。图4（a）为miR-15a超表达后Western blotting方法检测β-酪蛋白含量的结果；图4（b）为灰度扫描分析酪蛋白表达的光密度分析结果，通过3个平行实验获得试验数据，结果显示与对照组相比，miR-15a mimics转染48 h后，奶牛乳腺上皮细胞中β-酪蛋白的表达水平显著降低（P＜0.05）。图4中，1为miR-15a过表达组；2为阴性对照组；3为空白对照组

图4 miR-15a过表达后奶牛乳腺上皮细胞β-酪蛋白的检测结果

3 讨论

乳腺是合成乳蛋白的重要器官。乳蛋白的组成成分和含量是衡量牛奶营养品质的重要指标，其质量分数高低不仅决定牛奶的风味水平，而且是乳制品企业的核心竞争力[13]。乳汁中最主要的营养物质是乳糖、蛋白质和甘油三脂。β-酪蛋白（CSN2）是牛乳中含量最高的乳蛋白，也是乳蛋白中含量最高的酪蛋白，β-酪蛋白代表乳腺上皮细胞分泌乳蛋白的多少[14]。在泌乳激素的刺激下，β-酪蛋白具有很强的表达活性，其调控成分能够指导靶基因在乳腺组织中高效表达[15]。所以本研究选择乳糖、甘油三脂和β-酪蛋白进行miR-15a对泌乳功能影响的研究指标。角蛋白18是奶牛乳腺上皮细胞的识别蛋白，在奶牛乳腺上皮细胞的鉴定中普遍应用[16-18]，所以本试验选择该方法进行奶牛乳腺上皮细胞的鉴定。

目前发现的miRNA作用于靶基因mRNA的具体机制有两种，一种是当miRNA序列与靶基因mRNA的3′UTRs碱基区域近乎完全配对互补结合时则进行剪切作用，促使靶基因的mRNA迅速地降解而抑制基因转录水平的表达；当miRNA与靶基因mRNA不完全互补配对结合时，则会抑制靶基因mRNA的翻译而发挥其调节功能，但是却不会造成靶基因mRNA的降解[19]。另外一种情况是miRNAs诱导其靶基因mRNA快速地脱腺苷酸化，造成靶基因mRNA的快速衰弱和表达量的降低而发挥作用[20-22]。乳腺的发育可历经胚胎期、青春期、妊娠期、泌乳期、退化期等一系列时期，同时也是雌性哺乳动物出生之后能够多次重复生长发育的唯一的器官。所以miRNAs作为基因转录后表达调节的小分子，如何调控乳腺的发育、泌乳、退化以及相关基因的表达研究具有重要的理论和实际意义。2009年，Tanaka等研究报道了miR-101a在小鼠乳腺中通过调节环氧酶-2的表达进而调节乳腺的发育[23]。2013年，Xu等研究发现在乳腺癌发生过程中，miR-148a/152-DNMT1信号通路可能起到重要的调节作用[24]。在小鼠的乳腺中，miR-126-3p特异性的参与了乳腺的发育过程，并且靶向调节孕酮受体，抑制小鼠乳腺上皮细胞的增殖以及-酪蛋白的分泌[25]。本实验室的王杰等人研究发现miR-152调控p-Stat5、p-mTOR、Cyclin D1蛋白表达，能促进乳腺上皮细胞增殖和乳蛋白合成[26]。目前国内外的研究中，miR-15a对奶牛乳腺发育及其泌乳功能的调控报道很少。本实验室从2012年开始关注miR-15a，发现其可以通过调节奶牛乳腺上皮细胞中生长激素受体起作用[8]。本研究通过在奶牛乳腺上皮细胞中过表达miR-15a，研究其对奶牛乳腺泌乳功能的影响，主要检测其对乳糖、甘油三酯、酪蛋白泌乳指标的影响，研究结果发现过表达miR-15a降低了奶牛乳腺上皮细胞的细胞活力，降低了乳糖和甘油三脂的分泌以及β-酪蛋白的表达，表明bta-miR-15a负调控奶牛乳腺细胞的泌乳功能，说明其极可能与退化期奶牛乳腺上皮细胞的凋亡作用有关。

4 结论

本研究证明bta-miR-15a可抑制奶牛乳腺上皮细胞乳糖、甘油三酯和β-酪蛋白的分泌表达，降低奶牛乳腺上皮细胞的细胞活力，表明bta-miR-15a负调控奶牛乳腺上皮细胞的泌乳功能。这为进一步研究miR-15a在奶牛乳腺发育及泌乳功能方面的作用提供了实验依据。

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