重组牛凝乳酶原与重组单峰驼凝乳酶原活化速率的初步比较*

普燕，张富春

(新疆生物资源基因工程重点实验室，新疆大学生命科学与技术学院，新疆乌鲁木齐，830046)

凝乳酶最先是以凝乳酶原的形式由胃黏膜细胞分泌，在胃的酸性环境下，酶原活化，从凝乳酶原的N端释放出42个AA的肽段(propeptide)，形成有活性的凝乳酶［1］。凝乳酶从进化上来源于胃蛋白酶家族，不同种属动物凝乳酶基因与蛋白的序列相似度极高［2］，将genbank获得的单峰驼凝乳酶与牛凝乳酶编码序列进行比对，其核酸与氨基酸的相似度分别为87.87% 和83.73%，比对两种酶原的propeptide氨基酸序列，相似度为76.2%。有研究报道，牛凝乳酶与单峰驼凝乳酶的晶体结构也极为相似［3］，但是二者对牛乳κ-酪蛋白的凝乳活力、非特异蛋白水解活力、对底物的催化效率却有显著差别。Kappeler等［4］克隆表达的单峰驼重组凝乳酶显示其凝乳酶活性比牛凝乳酶高70%，而非特异水解活性却只有其20%。这些研究结果也显示两种酶一级结构和三级结构的相似性不能掩盖其分子水平的差异，而这些分子水平的细微差异有时却显出其独特性。

关于重组牛凝乳酶的原核表达研究已经有20多年的历史，1990年即被美国食品与药品管理局批准成为第一个安全并可运用于食品的重组酶［5］。实验依照重组牛凝乳酶的表达与复性方法，获得了重组单峰驼凝乳酶原，对其进行酸化/中和处理以获得成熟单峰驼凝乳酶时，发现两者活化速率有显著差别，牛凝乳酶原活化速率较单峰驼凝乳酶原高很多，用牛凝乳酶原N端序列代替单峰驼凝乳酶原相应序列，融合蛋白并没有表现出更高的活化速率，本文对此进行了研究与探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种和质粒

大肠杆菌 E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)、表达载体 pET30a、pET30a-c-proCHY、pET30a-b-proCHY、pGEX-4T-1-proCHY-BC为本实验室保存;突变载体pET30a-MUT-1和pET30a-MUT-2由武汉转导生物科技发展有限公司构建;所有重组表达质粒送上海生工公司测序以保证序列正确。

1.1.2 试剂

蛋白Marker购于北京康为世纪生物科技有限公司和大连宝生物工程有限公司，其他试剂为国产分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 重组蛋白大量表达与包涵体复性［6］

诱导表达1 L菌液，8 000 r/min离心1 min后除去培养基上清，菌体沉淀用20 mL PBS洗涤3次，加18 mL 细胞裂解液(50 mmol/L Tris-HCl，2 mmol/L EDTA，pH 8.0)，2 mL 10%Triton X-100，加苯甲基磺酰氟(PMSF)至终浓度为1 mmol/L及添加溶菌酶至终浓度1 mg/mL，冰浴30 min，超声至菌液不再黏稠。12 000 r/min离心20 min，弃去上清，沉淀加20 mL细胞裂解液和2 mL 2%脱氧胆酸，冰浴30 min，期间不断搅拌。12 000 r/min离心15 min，弃去上清，重复洗涤3次。加6 mol/L尿素溶解包涵体，12 000 r/min离心去除不溶杂质，将溶液装入透析袋中，放入约50倍体积的 TE透析液(20 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0)中透析，每12 h换一次尿素含量从高向低逐级递减的透析液，最后用不含尿素的透析液透析3次，12 000 r/min离心20 min，将上清液分装保存。

1.2.2 酶原活化(即酸化/中和处理)

将获得的重组凝乳酶原或融合蛋白用1 mol/L HCl调pH到2.0(或根据实验需要调至不同的pH)，室温放置2 h(或根据实验需要放置不同的时间)，再用1.5 mol/L Tris回调pH到6.0，制样，进行SDS-PAGE电泳。

1.2.3 牛凝乳酶原不同活化时间检测

将重组牛凝乳酶原(N端融合GST标签)用1 mol/L HCl调pH到2.0并开始计时，分别在活化5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、90 min、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h 和4 h取样，迅速置于沸水中制样，用SDS-PAGE电泳检测酶原的活化情况。

1.2.4 单峰驼凝乳酶原不同活化时间检测

图1 两种融合蛋白的序列设计简图Fig.1 The sequence of the two fusion proteins(The different AA were showed in bold and the autocatalytic site was showed with the arrow)

将重组单峰驼凝乳酶原用1 mol/L HCl调pH到2.0 并开始计时，分别在活化 2 h、3 h、4 h、5 h、17 h和3 d时取样，迅速置于沸水中制样，用SDS-PAGE电泳检测酶原的活化情况。

1.2.5 验证PBS和PB中能够加速单峰驼凝乳酶原活化的离子试验

称取 8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4和0.24 g KH2PO4，分别将这4种试剂溶于100 mL灭菌去离子水中，4℃保存。进行离子验证试验时，将这4种溶液分别以1∶10的比例加入到TE透析复性的单峰驼凝乳酶原中，调pH到2.0，室温放置2 h，再将pH回调至6.0，取样进行SDS-PAGE电泳检测分析。

1.2.6 融合蛋白表达载体的序列设计

用牛凝乳酶原propeptide序列部分或全部(见图1中下划线序列)代替单峰驼凝乳酶原的相应propeptide序列，融合后的序列见图1所示:融合蛋白MUT-1是将牛凝乳酶原的剪切位点附近的一段氨基酸序列(包括propeptide C端的41和42位氨基酸以及成熟肽N端的1-6位氨基酸)替换了单峰驼凝乳酶原相同位置的氨基酸残基;融合蛋白MUT-2是将单峰驼凝乳酶原N端的一段序列完全替换成牛凝乳酶原氨基酸序列(包括propeptide全长以及成熟肽N端的1-6位氨基酸)。

2 结果

2.1 重组单峰驼凝乳酶原与牛凝乳酶原在相同条件下活化速率比较

2.1.1 两种凝乳酶原酸化/中和处理2 h结果

取适量TE透析复性的单峰驼凝乳酶原和牛凝乳酶原，按照方法1.2.2活化2 h，分别制样进行SDS-PAGE电泳检测，发现牛凝乳酶原在2 h之内全部自剪切形成凝乳酶(图2B)，而单峰驼凝乳酶原在2 h内只产生非常少量的凝乳酶(图2A)。

2.1.2 牛凝乳酶原不同活化时间检测

图2 凝乳酶原活化2 h的结果Fig.2 The activation of the two prochymosins within 2 hours

根据上述结果，牛凝乳酶原在活化2 h之内能全部发生自剪切形成凝乳酶，为探究该过程中酶原的剪切与凝乳酶的产生趋势，我们进行了凝乳酶原活化不同时间的检测，发现酶原在活化5 min之内就迅速发生自剪切，大部分酶原被切割形成凝乳酶和GST-propeptide(见图3中箭头所示)，2 h内酶原能全部水解。

2.1.3 单峰驼凝乳酶原不同活化时间检测

从2.1.1结果来看，单峰驼凝乳酶原活化2 h获得的凝乳酶量很少，延长活化时间后，我们发现在pH2.0的酸性条件下，单峰驼凝乳酶原较缓慢地发生自剪切，到17 h时，酶原才切割了一半，在活化3 d时，凝乳酶原基本自剪切完。但在强酸环境下，也导致蛋白的降解(见图4最右边的泳道)。

2.1.4 比较TE和PBS、PB透析单峰驼凝乳酶原的活化速率

根据2.1.1和2.1.3结果来看，原核表达并复性获得的单峰驼凝乳酶原保留有完全的自剪切功能，只是自剪切的速率较牛凝乳酶原低很多。对于凝乳酶自身来说，长时间的强酸环境会导致蛋白降解(见图4最后一条泳道)。同时，较慢的活化速率对今后的工业化生产不利，会占用更多设备，增加成本。是否存在某些离子能加速酶原的自剪切，我们考虑到更换蛋白透析液来改变酶原溶液中的离子。常用的蛋白透析液除了上述的TE之外，还有PBS、PB、TBS等缓冲液，选择实验室常用的PBS和PB对6 mol/L尿素溶解的单峰驼凝乳酶原包涵体进行透析。透析完成后比较TE与PBS、PB透析单峰驼凝乳酶原的活化速率，见图5，明显发现PBS和PB透析的单峰驼凝乳酶原比TE透析的酶原活化速率高，从未剪切的凝乳酶原量来比较，我们可以看出PBS和PS透析酶原在2 h时发生剪切的酶原量相当于TE透析蛋白8 h剪切的酶原量。

图3 融合GST标签的牛凝乳酶原不同活化时间的检测Fig.3 The activation of the bovine prochymosin with GST tag by different time

图4 单峰驼凝乳酶原不同活化时间的检测Fig.4 The activation of the camel prochymosin by different time

2.1.5 PBS和PB中的Na+能够加速单峰驼凝乳酶原的活化

PBS和PB两种缓冲液均能加速单峰驼凝乳酶原的活化，为探究哪种离子最终起到了作用，我们将这两种缓冲液中包含的4种离子分别以透析时的浓度加入到TE透析复性的单峰驼凝乳酶原中，调pH到2.0，室温放置2 h，取样进行 SDS-PAGE检测分析。结果显示，加速酶原活化的是Na+。如图6所示，加入Na+的酶原活化速率明显比加入其他离子的酶原活化速率高，比较未加任何离子的酶原活化速率，加入其他离子几乎没有提高酶原的活化速率。

图5 TE、PBS、PB透析单峰驼凝乳酶原的活化速率比较Fig.5 The activation rate comparison of the different camel prochymosins which dialysed by TE，PBS and PB

2.2 单峰驼凝乳酶原序列与牛凝乳酶原序列融合蛋白的表达与检测

图6 TE透析单峰驼凝乳酶原中加入不同离子的活化速率检测Fig.6 The activation rate comparison of the camel prochymosins(TE dialysis)by adding different ions

使用相同的表达条件和酸化/中和步骤，获得的重组牛凝乳酶原和单峰驼凝乳酶原活化速率差别显著，这是否与牛凝乳酶原和单峰驼凝乳酶原的自剪切位点及propeptide序列有关，将牛凝乳酶原自剪切位点附近的氨基酸序列和propeptide序列替换单峰驼凝乳酶原相应序列，构建了两个融合蛋白，并进行了融合蛋白的原核表达纯化与自剪切功能的检测。

2.2.1 融合蛋白表达载体的设计与构建

用DNAMAN软件将牛凝乳酶原和单峰驼凝乳酶原氨基酸序列进行比对，见图7，发现二者propeptide序列中有10个氨基酸不同，牛propeptide序列比单峰驼propeptide少一个碱性氨基酸。比对结果还可以看出在自剪切位点附近，二者氨基酸序列差异很大，尤其是氨基酸的带电荷情况差异明显。是否因为这些氨基酸残基的不同而导致两种酶原活化速率的悬殊，我们设计了两个融合蛋白，即用活化速率高的牛凝乳酶原propeptide序列部分或全部代替单峰驼凝乳酶原的propeptide(序列设计见方法1.2.6)，一方面验证propeptide的序列能否决定酶原的活化速率，另一方面也期望获得较高活化速率的融合单峰驼凝乳酶原。

图7 牛凝乳酶原与单峰驼凝乳酶原propeptide序列比对(框中显示两种酶原的propeptide序列，箭头指示酶原自剪切位点)Fig.7 The sequence alignment between the bovine and camel propeptide(the propeptide sequences were framed and the autocatalytic site was showed with the arrow)

2.2.2 融合蛋白大量表达与活化情况的检测

将两个融合蛋白核酸序列构建到pET30a原核表达载体上，经测序确定序列正确后进行大量表达与纯化，获得MUT-1和MUT-2两个融合蛋白。

用HCl调酶液pH到2.0，分别在不同时间(10 min、20 min、30 min、1h、2h、4h)取样，进行 SDS-PAGE电泳检测，发现融合蛋白MUT-1无论活化时间长短，均不能进行剪切，而MUT-2表现出类似于单峰驼凝乳酶原的活化速率(见图8)。

将融合蛋白MUT-1在不同的pH(1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)条件下进行活化处理，发现MUT-1均不能发生剪切(见图9)。

在MUT-2酶液中加入终浓度为0.9 g/L NaCl，SDS-PAGE电泳检测活化1～6 h的情况，发现其自剪切情况与单峰驼凝乳酶极其相似(见图10)，Na+能大大提高酶原的活化速率。

图8 检测MUT-1和MUT-2在pH 2.0条件下不同时间的活化情况Fig.8 The activation of the MUT-1 and MUT-2 in pH2.0 by different time

3 讨论

图9 检测MUT-1在不同的pH条件下的活化情况Fig.9 The activation of the MUT-1 in different pH values

图10 加入0.9 g/L NaCl的MUT-2活化情况Fig.10 The activation of the MUT-2 by adding 0.9g/L NaCl

单峰驼凝乳酶于2006年被克隆表达及酶学特性鉴定，发现其c/p值优于牛凝乳酶［4］，2009年报道其制备的干酪拥有更好的质地与风味，比小牛凝乳酶更适合制作cheddar干酪［7］后，同年黑曲霉发酵生产的重组单峰驼凝乳酶上市出售，同时，骆驼凝乳酶的基因与蛋白序列［8］以及用骆驼凝乳酶制备干酪［9］等均被申请国际专利。由于骆驼凝乳酶具有比牛凝乳酶更高的催化活性，目前很多研究围绕骆驼凝乳酶展开，如检测其对牛乳中 κ-酪蛋白［10］以及 αs1-、β-酪蛋白［11］的水解肽谱，凝乳酶与底物的结合等［3，12-14］，其已然成为凝乳酶催化的分子机理研究和如何对凝乳酶进行点突变以提高凝乳活力的研究材料。Jensen等人［3］对黑曲霉表达的重组单峰驼凝乳酶进行了分离和鉴定，他们分离出了6种不同的酶类型(variant)，其中有4种酶类型被黑曲霉进行了糖基化，两种没有被糖基化，并且发现没有被糖基化的酶活力比糖基化的酶高。本实验利用大肠杆菌成功表达重组骆驼凝乳酶原并获得有活性的重组骆驼凝乳酶，而大肠杆菌不具有蛋白翻译后加工的特性，故不会对重组骆驼凝乳酶进行糖基化，由此我们认为大肠杆菌表达纯化获得的重组骆驼凝乳酶将会有更优的凝乳活力。

在哺乳动物体内，凝乳酶原活化发生在胃酸环境中。体外实验得出结论，当pH低于5.0时，凝乳酶原发生活化，剪切特定位点的肽键，释放N端的42个AA(propeptide)，形成有活性的凝乳酶［15］。凝乳酶属于天冬氨酸蛋白酶家族，该家族已有的晶体结构显示出各个成员结构极其相似，均包含很多β折叠，形成两个类似对称的结构域，中间是底物结合区［15］。目前只报道了牛凝乳酶的晶体结构，没有牛和骆驼凝乳酶原的晶体结构，我们用已报道的猪胃蛋白酶原A的晶体结构进行酶原结构的描述。酶原中propeptide形成3个短α螺旋，在N端形成一个β折叠，该β折叠刚好位于酶的活性中心，覆盖了底物结合位点，防止底物进入酶活中心，同时让酶在中性条件下保持无活性状态。当在酸性环境下，propeptide与酶的静电结合作用被破坏，从而引起构象改变，propeptide被切割后释放，propeptide与酶活性中心解离后，酶的活性位点暴露，从而对底物具有催化活性［16-17］。

关于酶原的激活，以牛凝乳酶原为例，其propeptide有两个切割位点，当pH为4～5时，酶原自剪切去除N端1-42 AA肽段，形成有活性的凝乳酶;当pH为2.0时，酶原自剪切去除N端1-27 AA肽段，形成假凝乳酶。假凝乳酶在pH低于3和pH高于6时相对稳定，但在pH 5.5时，会继续加工形成凝乳酶。同时，假凝乳酶和凝乳酶都具有相同的活性［18］。目前，关于牛凝乳酶原常用的活化方法是，将酶原pH调至2.0，室温放置2h，再回调pH到6.0，后续进行凝乳酶的纯化。单峰驼凝乳酶原的原核表达目前还没有见报道，kappeler等［4］表达的重组单峰驼凝乳酶是在黑曲霉宿主中表达的，该文中没有提到单峰驼凝乳酶原的活化，有可能在发酵过程中酶原发生自动剪切直接产生成熟的单峰驼凝乳酶，Vallejo等用真核表达系统表达牛凝乳酶原或水牛凝乳酶原，同样是直接表达出凝乳酶而不是酶原［19-21］。本实验原核表达的重组单峰驼凝乳酶原是通过包涵体溶解复性获得的，采用牛凝乳酶原活化常用方法对其进行活化，发现其活化效率比牛凝乳酶原低很多。牛凝乳酶原在pH 2.0条件下，2 h内完全活化，而单峰驼凝乳酶原需要3 d以上，这种差异可能是由于两者propeptide序列不同造成的。不同酶原由于一级氨基酸序列不同，其propeptide与酶活性位点的静电结合作用强弱不同，从而导致酶原的活化速率不同。如人胃蛋白酶原的两种同工酶原A-3、A-5，序列上只有1个氨基酸的区别，前者43位是Glu，而后者是Lys，与此同时，A-5的活化速率比A-3低，理论上推测是由于A-5多了1个带正电荷的氨基酸，故与酶活位点静电荷作用增强之故［15］。对骆驼凝乳酶原和牛凝乳酶原进行propeptide序列比对，其相似度为76.2%，有10个氨基酸残基不同，且单峰驼凝乳酶原的propeptide序列比牛凝乳酶原多一个碱性氨基酸。在自剪切位点附近，两个序列因为氨基酸的差别而导致极性与所带电荷差别很大(见图7)。是否因为propeptide的这些差异导致2种重组酶原活化速率的差异，本试验做了2种突变。

将牛凝乳酶原自剪切位点附近序列和牛凝乳酶原的N端序列分别代替单峰驼凝乳酶原中的相应序列，构建2个融合蛋白MUT-1和MUT-2(具体方法见1.2.6)，以期获得具有牛凝乳酶原高活化速率的融合单峰驼凝乳酶原，这样该酶原进行工业化发酵生产时，能缩短生产周期，节约成本。

将这2个融合蛋白通过相同表达体系大量表达并复性后，经活化处理检测其活化速率，发现融合蛋白MUT-1在任何pH条件均不能获得有活性的单峰驼凝乳酶。这可能由于替换的序列位于自剪切位点附近，该序列不能被酶识别并剪切，或是对propeptide与酶的结构有一定影响，不能发生构象改变及切割。融合蛋白MUT-2的活化速率以及添加NaCl能提高活化速率的实验结果与单峰驼凝乳酶原自身活化情况很相似。这也提示酶原的剪切不仅仅涉及propeptide序列和自剪切位点，成熟酶的结构、酶活以及其与propeptide的相互作用等都可能对酶原的活化有影响。

Kašpar等［23］在牛凝乳酶原的N端第5个残基前插入了不同长度的SV40病毒的小t抗原序列，包括小t抗原 N 端93、63、47、12和1个 AA，构建出几个融合酶原。经检测，只有融合47和12个AA的酶原产生稳定的蛋白产物并且只有后者能活化产生凝乳酶，融合93和63个AA的酶原都不稳定而被降解。这说明，在酶原的N端融合不同长度的肽对酶原的正确折叠有影响。我们实验中表达载体使用的是pET30a，该表达载体会在外源蛋白前融合一个6 His标签，同时标签与酶原中还存在一段连接序列，共50个AA，这些 AA都位于酶原的 N端，也许会对propeptide序列的三级结构形成有一定影响，或是空间位阻不利于酶对自剪切位点的催化。当然，关于相同标签位于牛凝乳酶原的N端为何没有对牛凝乳酶原的活化产生影响，推测这些差异可能还是源自两种酶原分子水平氨基酸序列的不同，如组成凝乳酶的氨基酸所带电荷不同，propeptide与酶活性中心的静电作用强度不同等，还需深入研究。

Justesen等［24］将牛凝乳酶原的propeptide部分序列插到标签和异源蛋白之间，目的是通过标签方便纯化目的蛋白，然后再通过凝乳酶对目的蛋白进行切割，最终得到不带任何标签的天然目的蛋白。Justesen等人只选取了牛凝乳酶propeptide C端的15氨基酸(理论 pI值低于7，而全长 propeptide pI值接近10)作为凝乳酶的识别位点连接到目的蛋白N端，结果融合蛋白在温和的条件下(pH6.2)就可以被凝乳酶识别并切割去除标签。利用网站(http://web.expasy.org/compute_pi/)分析牛凝乳酶原和单峰驼凝乳酶原的propeptide的pI值，分别为9.7和10.37，若计算N端的his标签和连接序列(共50个AA)，二者pI值分别为6.70和8.12，的确牛凝乳酶的序列所带电荷更少。缩短重组凝乳酶原的propeptide序列可以降低propeptide与酶活性位点的静电作用，能在偏中性的pH条件下被切割。酶原propeptide与成熟酶之间是静电结合作用，减少其之间的静电作用可以提高酶原的活化速率，这可能是因为较弱的静电作用使propeptide与成熟酶结合较松，这样更容易进行活化所必需的构象转变［15］。下一步将对单峰驼凝乳酶原的propeptide序列进行氨基酸点突变，减少带正电荷的数量，或是缩短propeptide序列，以期提高酶原的活化速率，为该酶的工业化生产提供技术支持。

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