BRMS 1通过下调NF-- κ BB核转位抑制成纤维样滑膜细胞分泌IILL--1 β

钟浩博，孙春汉，马 晋，郑少伟，陈楚群，赖伟强，杨剑锋，孙江森

惠州市第一人民医院骨科，广东 惠州 516001

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种累及周围关节组织为主的自身免疫性疾病，以非化脓性增生性滑膜炎为特点，形成侵袭性血管翳，逐渐导致关节软骨的破坏及关节功能的障碍［1］。在RA的发病机制中，成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synovial cells,FLS）可以分泌促炎因子TNF-a、IL-1β等，参与关节炎症和关节破坏［2-3］。乳腺癌转移抑制基因(breast cancer metastasis suppressor 1,BRMS1）是一类重要的抑制转移的基因［4］，新近发现BRMS1也有抑制有促炎作用的核转录因子NF-κB核转位的作用［5］。那么，BRMS1在RA中是否可以抑制NF-kB介导的炎症，尚不可知。因此，本研究旨在探讨BRMS1在RA中的作用及其机制。

1 材料和方法

1.1 材料

高糖型DMEM、胎牛血清（美国Gibco公司），胰蛋白酶（美国Gibco公司）。IL-1β Elisa试剂盒（美国BD公司）。BRMS1、p-IkKa/b、IkKa/b 、IkBa、NF-κB和IL-1β抗兔二抗（美国CST公司）。核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒（凯基生物技术公司）。脂多糖（LPS）（日本日本化药株会社）。

1.2 取材和FLS原代分离。

4例符合1987年美国风湿病学会（ARA）修订的RA分类标准［3］的女性病人滑膜标本，取自惠州市第一人医院骨外科行关节置换或关节镜手术患者，4℃保存。病人年龄37～58岁，平均47±13岁，病程6～19年，平均10±8.4年。另外分别取1名外伤手术无关节疾病患者膝关节滑膜组织。参照黄宪章等［6］人的方法分离原代FLS。无菌条件下剪碎，剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的组织块，吸弃过多培养基。用无菌吸管吸气组织块，均匀喷洒于25 cm2细胞培养瓶底，倒置培养瓶，加入4 ml 10%培养基。在5%CO2的37℃孵箱中培养12 h后缓慢翻转培养瓶，继续培养。培养1周后可见组织块周围有大量细胞，可用PBS冲洗去除组织块继续培养，待细胞长满至70%左右消化传代。本实验中采用3～5代滑膜成纤维细胞，型别均一，纯度可达98%。

1.3 慢病毒转染

由吉凯公司合成慢病毒。第三代处于对数生长期的滑膜成纤维细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液。将细胞悬液（细胞数约为1×106）接种于12孔板中，37℃5%CO2培养箱培养待细胞融合度达到约50%。按MOI值（病毒滴度/细胞数）50，加入适宜量的病毒。12 h后观察细胞状态：如果没有明显的细胞毒性作用，继续培养24 h后更换培养基；如果有明显的细胞毒性作用，立即更换培养基。感染72 h后观察细胞荧光率，同时收集部分细胞Western blot检测BRMS表达变化。

1.4 Western blot检测蛋白水平。

60 mm皿收集细胞，按凯基核蛋白提取试剂盒（货号KGP150）说明提取核蛋白及胞浆蛋白。Bradford法测定蛋白浓度。5%浓缩胶80 V衡压30 min，10%分离胶恒压110 V，40 min，湿转120 mA恒流50 min，37℃摇床5%BSA封闭2 h，转印后加入一抗4℃过夜。TBST洗膜5 min×3次，山羊抗兔或山羊抗鼠近红外二抗 1∶15000，常温避光摇床孵育1.5 h，避光TBST洗膜15 min×4次。Odyssey V3.0扫描仪扫描膜。重复3次。

1.5 Elisa检测细胞培养液中IL-1β。

以含1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液为封闭液，每孔350 μl，室温封闭 1 h。封闭结束后，弃去封闭液，洗板，加入待测样品（制作标准曲线以标准Purified Rat IgG代替样品）100 μl，室温25±2 ℃孵育 2 h。一抗孵育结束后，洗板，每孔加入Anti-rat IgG-HRP Antibody 100 μl，室温孵育2 h。酶标二抗孵育结束后，洗板，每孔加入TMB底物溶液100 μl，室温避光显色30 min后，每孔加入2 mol/L H2SO450 μl终止反应。用酶标仪在450 nm处检测OD值。绘制标准曲线，通过标准曲线计算样品浓度。

1.6 免疫荧光检测NF-κB核转位。

处理好细胞后，去除培养基，PBS洗1次，多聚甲醛固定 20 min，PBS洗3次，每次3 min；2.5%Triton-100室温封闭 10 min，PBS洗3次，每次3 min；200 μl FBS室温封闭 1 h，滴加1∶200稀释50 μl NF-kB一抗，4 ℃过夜，PBS洗3次，每次3 min；然后加1∶200 FITC标记的羊抗兔IgG二抗200 μl，室温避光孵育1 h，PBS洗3次，每次3 min；最后用DAPI染核，室温避光孵育5 min，PBS洗3次，每次3 min；在荧光显微镜下观察。

1.7 统计学分析

应用SPSS 13.0统计学软件，采用One-way ANOVA方差分析法，首先利用Levene方法进行方差齐性检验，确定方差齐性且整体比较组间差异有统计学意义后进一步作多重比较，多重比较采用LSD法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RA组FLS细胞BRMS1蛋白、核蛋白中NF-κB表达和培养基上清中IL-1β水平

收集第3代FLS细胞提取总蛋白、核蛋白及胞浆蛋白，Western blot检测BRMS1蛋白、核蛋白中NF-kB表达。结果显示，RA组FLS细胞BRMS1和IkBα蛋白较normal组明显降低，但是IkKα/β磷酸化水平及核蛋白中NF-κB表达较normal组明显升高（图1A）。Elisa结果显示，RA组培养基中IL-1β水平也较normal组明显升高（图1B）。

图1 RA组FLS细胞BRMS1蛋白、核蛋白中NF-kB表达和培养基上清中IL-1β水平的差异

2.2 过表达BRMS1下调NF-κB核转位和IL-1β表达

慢病毒法在RA组FLS中过表达BRMS1，Western blot检测结果显示慢病毒转染BRMS1后，FLS细胞BRMS1表达明显升高（图2A）。进一步检测胞浆蛋白中IkKα/β磷酸化水平和IkBα蛋白表达，核蛋白中NF-kB的表达水平。结果显示过表达BRMS1后，IkBα蛋白表达增加，IkKα/β磷酸化水平及核蛋白中NF-κB的表达水平明显减少（图2A）。免疫组化结果可见，过表达BRMS1后，细胞核中NF-κB明显减少（图2B）。Elisa检测发现，过表达BRMS1组细胞培养基上清中IL-1β水平明显下调（图2C）。

图2 过表达BRMS1对NF-κB核转位和IL-1β表达的影响

2.3 过表达BRMS1抑制LPS诱导的NF-κB核转位和IL-1β表达

Normal组的FLS细胞过表达BRMS1后，予LPS 10 ng/ml处理1 h后提取蛋白。Western blot检测结果显示，BRMS1+LPS组IkKα/β磷酸化及核蛋白中NF-κB水平较NC+LPS组明显减少（图3A）。培养基上清Elisa检测结果显示，BRMS1+LPS组IL-1β也较NC+LPS组明显减少（图3B）。

3 讨论

成纤维样滑膜细胞（FLS）是关节滑膜内层主要的细胞之一。在正常正常情况下，FLS在保持关节内环境稳态方面发挥着重要功能。但是在类风湿性关节炎（RA）患者的关键滑膜组织中，FLS除了呈肿瘤样增生，造成细胞数量的大量增加，造成软骨破坏的一个重要原因；另一方面，FLS可以对许多促炎症因子有响应，而且其自身也能够合成并分泌许多因子介导炎症反应［7］，激活血管内皮细胞，增强内皮细胞粘附分子的表达，使血液中的白细胞被汇集到关节腔内；刺激软骨细胞和破骨细胞、骨膜细胞，使糖蛋白的合成减少、降解增加，同时产生释放骨钙的胶原酶和其他中性蛋白酶，从而导致软骨和骨破坏［8-9］。

核转录因子Kappa-B（NF-κB）在FLS分泌炎症因子中有重要作用。在RA的FLS中，NF-kB活化可以促进IL-1β、IL-8、IL-6、MMPs的产生，促进FLS增生，抑制FLS凋亡，从而促进滑膜血管翳形成，使细胞释放更多的细胞因子和MMPs，进一步增强IkKβ的功能，诱导NF-κB核转录，形成恶性循环［10-12］。我们的实验结果也显示，在RA病人的FLS中，NF-κB通路的活化较normal组明显升高。Okamoto等［13］也发现，通过抑制NF-κB核转位可以明显改善RA病人的并且进展。可见，NF-κB在FLS参与破坏RA病人关节结构过程中有重要作用。

图3 过表达BRMS1对LPS诱导的NF-kB核转位和IL-1β表达的影响

BRMS1在抑制肿瘤发生和转移中有重要作用［14］；同时，研究也发现BRMS1可以抑制IkKα/β磷酸化，减少IkBα蛋白降解，从而抑制NF-κB的核转位和该通路的活化［5］。我们对比了正常的和RA患者的FLS细胞中BRMS1蛋白表达，发现RA患者FLS细胞中BRMS1蛋白表达明显下降。而在RA患者的FLS细胞中，过表达BRMS1蛋白后，NF-κB的核转位被明显抑制，同时IL-1β的分泌明显减少。为了进一步明确BRMS1蛋白对NF-κB的作用，在normal组的FLS细胞中过表达BRMS1蛋白，再用NF-κB通路的激活剂LPS刺激细胞，发现BRMS1可以减弱LPS诱导的NF-κB通路的激活和IL-1β的分泌。

综上所述，BRMS1可以通过抑制NF-kB核转位，抑制FLS分泌炎症因子IL-1β，这可能成为治疗RA的一个靶点。

［1］ Ai J,Duan J,Lv X,et al.Overexpression of FoxO1 causes proliferation of cultured pancreatic beta cells exposed to low nutrition［J］.Biochemistry,2010,49(1):218-25.

［2］ Yamanishi Y,Firestein GS.Pathogenesis of rheumatoid arthritis:The role of synoviocytes［J］.Rheum Dis Clin North Am,2001,27(2):355-71.

［3］ Muller-Ladner U,Pap T.Pathogenesis of RA:more than just immune cells［J］.Z Rheumatol,2005,64(6):396-401.

［4］ Phadke PA,Vaidya KS,Nash KT,et al.BRMS1 suppresses breast cancer experimental metastasis to multiple organs by inhibiting several steps of the metastatic process［J］.Am J Pathol,2008,172(3):809-17.

［5］ Cicek M,Fukuyama R,Welch DR,et al.Breast cancer metastasis suppressor 1 inhibits gene expression by targeting nuclear factorkappa B activity［J］.Cancer Res,2005,65(9):3586-95.

［6］ 黄宪章,王 前,郑 磊,等.人类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞培养及生物学特性研究［J］.南方医科大学学报,2009,29(3):462-5.

［7］ 贺琤雯,沈 茜.滑膜成纤维细胞在类风湿性关节炎发病中的作用［J］.国际免疫学杂志,2010,33(2):117-20.

［8］Wang XP,Lin QD,Lu PH,et al.Association of HLA-DQB1 coding region with unexplained recurrent spontaneous abortion［J］.Chin Med J(Engl),2004,117(4):492-7.

［9］ SU,PA,GP,et al.HLA allele associations in idiopathic recurrent spontaneous abortion patients from India［J］.J Hum Reprod Sci,2008,1(1):19-24.

［10］Xu H,He Y,Yang X,et al.Anti-malarial agent artesunate inhibits TNF-alpha-induced production of proinflammatory cytokines via inhibition of NF-kappaB and PI3 kinase/Akt signal pathway in human rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes［J］.Rheumatology(Oxford),2007,46(6):920-6.

［11］Lauder SN,Carty SM,Carpenter CE,et al.Interleukin-1 beta induced activation of nuclear factor-kappa b can be inhibited by novel pharmacological agents in osteoarthritis［J］.Rheumatology(Oxford),2007,46(5):752-8.

［12］申成凯,吕成昱,王英振,等.白介素-1β基因多态性与晚期膝骨关节炎易感性的关联性研究［J］.中华关节外科杂志:电子版,2013,7(3):378-85.

［13］Okamoto H,Yoshio T,Kaneko H,et al.Inhibition of NF-kappa B Signaling by Fasudil as a Potential Therapeutic Strategy for Rheumatoid Arthritis［J］.Arthritis Rheum,2010,62(1):82-92.

［14］Seraj MJ,Samant RS,Verderame MF,et al.Functional evidence for a novel human breast carcinoma metastasis suppressor,BRMS1,encoded at chromosome 11q13［J］.Cancer Res,2000,60(11):2764-9.