口蹄疫病毒TaqMan 实时荧光定量PCR检测试剂盒的比较试验

蔡顺萍 李 幸 王瑞深

(1.深圳市光明新区动物卫生监督所,广东深圳 518107;2.深圳市光明新区光明动植物防疫检疫站,广东深圳 518107)

口蹄疫病毒TaqMan 实时荧光定量PCR检测试剂盒的比较试验

蔡顺萍 李 幸 王瑞深

(1.深圳市光明新区动物卫生监督所,广东深圳 518107;2.深圳市光明新区光明动植物防疫检疫站,广东深圳 518107)

本研究通过对深圳市场上常见的3个品牌（A，B，C）的口蹄疫病毒TaqMan 实时荧光定量PCR检测试剂盒的外观和物理性状、特异性、灵敏度、重复性和稳定性符合率进行比对。结果显示，试剂盒A外包装完整，标签牢固且采用了具有隔热层的冻存管保存关键性试剂，包装较为科学；3家试剂盒中反应时间最长的C（61.75min）与最短的B（56.75min）相差5min；A，B，C试剂盒对口蹄疫阳性样本检测均呈阳性，对猪瘟等6种非口蹄疫阳性样本检测呈阴性；A比B试剂盒的检出Ct值提前1～2个Ct值，比C试剂盒检出Ct值提前1～4个Ct值；在样本浓度相对高时（稀释梯度≥2×10-4），3个厂家的试剂盒都较稳定，在样本浓度相对低时（稀释梯度在2×10-5时），3个厂家试剂盒都有不同程度的不稳定，A试剂盒3个平行样均有阳性扩增，但其中一个样检出荧光增量相对较低；B和C试剂盒均出现无扩增样品。结论：3家试剂盒中，A产品使用具有隔热层的冻存管保存关键性试剂，且灵敏度较高、特异性较强、稳定性较佳，适用于临床检测。

荧光定量PCR 口蹄疫病毒 试剂盒比对

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒引起的急性、热性、高度传染性人畜共患病，被世界动物卫生组织（OIE）列为15个A类传染病之首。口蹄疫不仅严重危害畜牧业生产，影响食品安全，而且危及人类的健康。同时由于口蹄疫发生范围较广，单纯依靠扑杀措施不仅难以控制疫情，还需付出巨大的代价。因此，世界上许多国家（包括我国）采取扑杀和疫苗接种相结合的防疫政策，所有大型养殖企业，偶蹄动物均需接受口蹄疫疫苗注射。但是，经过免疫的动物群携带病毒的现象仍时有发生，且免疫动物群中感染的微量病毒在免疫压力的作用下，有可能进一步发生抗原变异，产生新的流行毒株[1]。动物接种疫苗后，常规的检测方法由于不能区分感染抗体和疫苗免疫抗体，无法通过抗体监测来发现病毒感染的动物群，致使对群体的野毒感染状况无法调查。此外，现今屠宰检疫主要依靠官方兽医临床检疫来确定动物是否感染口蹄疫病毒，当遇到病畜感染初期或感染多种病菌而导致临床病症不明显时，官方兽医的临床检疫存在一定的困难，且存在一定的误判。

实时荧光PCR技术，因其具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点而被广泛应用于分子生物学研究、医学研究和动植物疾病诊断中。因此，众多动物疫病的国标检测方法中，都包含了实时荧光PCR技术。作为一种法定的诊断方法，该技术应用于口蹄疫检测也将成为预防动物疫病和动物部品检疫的必然方向。目前，市场上检测口蹄疫病毒的荧光试剂盒种类繁多，进口试剂盒价格昂贵；而国产试剂盒性价比高，但质量参差不齐。因此，为评估国产试剂盒的质量，本研究对深圳市场上常见的3家口蹄疫试剂盒进行各项指标的比对，为实验室进行临床检验提供一定的依据。

1 材料

1.1 试剂盒

采购深圳市场上3家口蹄疫病毒实时荧光PCR检测试剂盒，分别用A、B、C代码表示。RNA提取试剂盒购自澳东生物制品有限公司。

1.2 阳性样本

口蹄疫病毒O型抗原购自中国农业科学院兰州兽医研究所。

1.3 疫苗

用于比对的猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2 型、猪细小病毒病疫苗购自武汉科前生物股份有限公司，此6种疫苗均已通过相应RT-PCR试剂盒确定为阳性样本。

表1 3种口蹄疫荧光PCR试剂盒的外包装和物理性质比较

1.4 主要仪器

由表1可看出，3家试剂盒外包装均完整无损，但A试剂盒相对B试剂盒，有标签稳固不易脱落的优点；相对于B和C试剂盒，使用了具有隔热层的冻存管保存关键性试剂，降低了酶等试剂因温度影响而失效的风险。因此，A试剂盒在包装上优于B和C试剂盒。

表2 3种试剂盒反应体系和反应总时间

3.2 反应体系和反应总时长

3家试剂盒中，反应体系的总时长最短的是B试剂盒的56.75min，其次是A试剂盒的58.83min，最长是C试剂盒的61.75分钟之间，最长与最短反应总时长相差5min（表2），反应体系总时长无太大的差异。

3.3 特异性

3家试剂盒经特异性实验结果显示，口蹄疫病毒0型样本提取的核酸检测结果均呈阳性，而猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2 型、猪细小病毒病提取的核酸检测结果均呈阴性，说明3种试剂盒都有较好的特异性（图1～图3）。

图1 A试剂盒特异性结果

图2 B试剂盒特异性结果

图3 C试剂盒特异性结果

3.4 灵敏度

3.4.1 Ct值的比较

根据3.2的3个试剂盒的反应体系对比可知，A试剂盒较B和C试剂盒多5个预循环，即检测同一样本时，该试剂盒检测结果显示的Ct值会比无预循环的试剂盒检测结果提前5个Ct值，因此，用于比对的A试剂盒检测结果的平均Ct值需额外加5个Ct值。

灵敏度检测结果显示（表3，图4～图6），将相同浓度样本的3个平行样的平均Ct值进行比对，A比B试剂盒的检出Ct值提前1～2个Ct值，比C试剂盒检出Ct值提前1～4个Ct值，即A优于B，优于C试剂盒。

图4 A试剂盒灵敏度实验结果

表3 3家试剂盒不同稀释浓度的Ct值对比

图5 B试剂盒灵敏度实验结果

图6 C试剂盒灵敏度实验结果

3.4.2 稳定性

同样由灵敏度结果（表3，图4、5、6）可知，在样本浓度相对高时，（稀释梯度≥2×10-4），3个厂家的试剂盒都较稳定，在样本浓度相对低时（稀释梯度在2×10-5时），3个厂家试剂盒都有不同程度的不稳定。其中在检测口蹄疫RNA（2×10-5浓度梯度）样本（3个平行样）时A试剂盒3个平行样均有阳性扩增，但其中一个样检出荧光增量相对较低；B试剂盒有一个样品有阳性扩增；C的试剂盒有两个样品阳性扩增。

取B和C试剂盒，按2.4.2实验方法对口蹄疫RNA（2X10-5浓度梯度）样本进行3个平行样的重复实验结果显示（图），B试剂盒检测的3个平行样中有一个阳性扩增，Ct值为38、15、34，C试剂盒检测的3个平行样均无扩增（见图7、8）。因此，A试剂盒的稳定性比B、C试剂盒较好。

图7 B家试剂盒检测口蹄疫RNA（2X10-5）3个平行样实验结果

4 结论

通过对A，B，C3家口蹄疫病毒荧光PCR试剂盒的外观，物理性质和对相同样本的特异性、灵敏度和重复性实验进行对比，结果显示：A产品使用具有隔热层的冻存管保存关键性试剂，且具有灵敏度较好，特异性强，重复性较好的特性。因此，A试剂盒要优于B和C试剂盒，更适用于临床检测筛选。

图8 C试剂盒检测口蹄疫RNA（2X10-5浓）3个平行样结果

5 讨论

世界动物卫生组织将口蹄疫列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病[5-6]。2013年至2014年，我国共计报告发生A型口蹄疫疫情22次，疫点分布广东、青海和云南等6个省、自治区。从监测阳性区域分布来看，我国口蹄疫病毒污染面较广，病原长期存在，清除难度大。除此，境外毒株传入风险增加，对我国口蹄疫防控构成重大威胁，每次从境外传入我国一个新毒株，就会引发一轮疫情，如2005年Asia1型、2009年Sea-97G1毒株、2010年O型Mya-98毒株、2013年A型Sea-97 G2毒株，分别在我国引起4次高发[7]。另外，猪群免疫状况参差不齐，存在疫情发生的风险，广东的肉猪群免疫效果一般，抗体合格率接近70%，存在隐性感染和发病的可能[8]。而且，跨省区动物移动频繁，也是导致病情扩散的原因。鉴于口蹄疫疫情危害的严重性和防控的困难性，及时、有效地检测出被感染病猪，是控制疫情暴发和蔓延的有效措施。实时RT-PCR快速检测方法的建立与应用，为动物卫生部及时确诊和有效处置口蹄疫疫情提供了坚实的技术支持。但是，随着商品化检测试剂盒的推出，在为检测工作带来便利的同时，由于不同厂家试剂盒的敏感性、特异性等有所差异，导致结果会有所偏差，有的甚至会漏检。因此，需要对这些商品化试剂盒进行评估，以便为选择最合适的试剂盒对口蹄疫病毒确诊提供技术依据。

本研究所选的3个厂家的试剂盒是目前深圳市场常用的试剂盒。我们试验表明，3家试剂盒均具有较好的特异性，但是依据各自评判标准的灵敏性和重复性试验结果显示，3个厂家试剂盒的有所差异，A试剂盒灵敏度和重复性最好，A检出Ct值比B提前1～2个，比C提前1～4个Ct值，而且样口浓度越低，差别越大；2X10-5浓度的3个平行样检测中，A均有扩增，其中一个平行样荧光增量较低，B和C均有1-3个平行样无扩增，这跟各家试剂盒的引物、探针的设计，反应体系和原材料的选择不同有很大的关系。因此，在检测样品的Ct值处于试剂盒判定的临界值时，建议重复检测，避免检测结果的误判。另外，在日常检测过程中，对商业化试剂盒进行定期的检测结果差异实验是很有必要的。

本研究所选择的试剂盒中，有采用核酸片断或克隆质粒作为阳性对照，无法质控核酸的提取过程。而病毒颗粒的传染性和裸RNA的不稳定性也无法作为RNA的理想质控品，已有应用的盔甲RNA质控品，是一种理想的质控品，可以弥补这一缺陷。

本研究的3家试剂盒，均需要经过提取RNA、反转录成cDNA 和PCR的3个步骤，从拿到样品到出RT-PCR检测结果，全程至少需要2 h。目前，已有直接扩增实时荧光RT-PCR技术的研究，该技术可以免去提取RNA的步骤，从样品处理到扩增完成，全程不超过1.5 h，极大地缩短了检测时间，如应用于临床检验检疫，将极高的提升检测效率，对于重大动物疫病的诊断，防控，以及保障公共卫生安全，具有重要意义。

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