动物饲料中常用磺胺药物的检测方法

薛瑞婷 李 栋 王改芳

(吕梁学院生命科学系,山西吕梁 033000)

动物饲料中常用磺胺药物的检测方法

薛瑞婷 李 栋 王改芳

(吕梁学院生命科学系,山西吕梁 033000)

作者对动物饲料中10种常用磺胺药物采用高效液相色谱-串联质谱进行检测，对样品经提取、净化、稀释及分离后对其进行质谱分析，在多反应监测模式下进行特征母-子离子对信号采集。10种磺胺类药物保留时间重现性好，峰形也处于理想的状态；且配合饲料的总离子流色谱图中背景基线稳定，未出现干扰的状况。除此之外，10 种磺胺类药物的平均回收率在70%～92%之间，且日内相对标准偏差在10%以内，日间相对标准偏差在15%以内，这说明高效液相色谱-串联质谱法适用于饲料多磺胺组的分析。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱-电喷雾串联质谱法采用高效液相色谱系统与三级四级杆串联质谱组成，离心机、真空氮气吹干仪、去离子水发生器以及12通道半自动固相萃取装置。10种磺胺主要包括：C10H10N4O2S、C11H12N4O3S、C11H12N4O3S、磺胺5-甲氧嘧啶、C11H13N3O3S、C11H12N4O3S、磺胺吡啶、C12H14N4O4S、磺胺二甲基嘧啶、C14H11N4NaO2S；所有磺胺的纯度均在95%-99%之间。除此之外还包括甲醇、剂量为500mg的6mLHLB固相萃取柱；实验过程中的用水均为去离子水。

采用甲醇将10种磺胺进行混合，其中，磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉的浓度配置在50mg/L，其余8种磺胺的浓度配置为100mg/L，然后将已经配置好的溶液存放与于温度在-18℃的环境下进行避光存放。最后贮备剂量为1.0mL的溶液，采用甲醇将溶液定容至剂量为 100mL后将其放在温度为0～4℃环境中保存4w，逐级稀释工作溶液后做到现配现用。

1.2 试验方法

1.2.1 提取样品及净化

工作人员应该称取剂量为5g的饲料样品，将其研磨混匀后将其放置于离心管中，然后在存有饲料样品的离心管中加入剂量为20mL的甲醇以及浓度为0.1mmol/L的盐酸，对溶液进行提取，充分地将溶液进行时间1min左右的涡动混合后将其置于常温水浴中，然后采用超声提取3次，30s/次。其次将超声提取后的溶液静置5min后在4 000 r/min下进行长达10 min的离心，然后取剂量为2.0mL的上清液，加入剂量为3.0mL的水进行涡动混匀后，确保其实现自然的流速过柱。依次采用 5mL的水及浓度为0.1mmol/L的盐酸洗涤SPE柱，在真空下1min抽干柱中残留液体。采用剂量为5.0mL的甲醇溶液对柱中存在的结合物进行洗脱，然后确保液体流动的速度控制在1mL/min内。除此之外，工作人员需要收集洗脱液，并且在温度为40℃左右环境的水浴下采用真空氮气吹干仪来对溶剂进行蒸发。然后工作人员采用适量的流动相来溶解残渣，将其经过0.45μm的水相滤膜过滤后对清液进行测定。工作人员在样品加标实验的过程中，称取适量的样品后在样品中加入磺胺类药物，最后将其放置在室温的环境下，放置10min后在溶液中加入提取溶液。

1.2.2 液质联用

色谱条件：工作人员应当设置碱性反相色谱柱参数为15cm×2.1mmi.d.；并且将柱温的温度控制在35℃左右；而流动相的浓度应当控制在1mmol/L左右，pH值为4.6；流速控制在0.3mL/ min；进样量为20μL。梯度洗脱的步骤为：在0.01min时采用浓度为80%的醋酸铵溶液，在8.0min内线性增长至浓度为52%的甲醇，然后在11min内线性降至浓度为50%的醋酸铵溶液，对其进行系统平衡。

质谱参数：工作人员应该将离子源温度设置为500℃左右，电力电压设定为4500V；并且需要将雾化气、气帘气以及加热辅助气的流量设置为8.0L/min。采用MRM为监测模式，其中SD的Q1为m/z251.1，SPD的Q1为250.1，SM1的Q1为265.1，SMZ的Q1为254.2，SDM的Q1为311.0，SQX的Q1为301.2；而相应的特征碎片离子Q3为m/z156，108，92；SM、SMP以及SMM的Q1为m/z281.2，SM的Q3为m/z156，SMP的Q3为108以及SMM的Q3为92；SM1的Q1 为m/z279.1，Q3为m/z156，186。③液质联用测定：将磺胺类药物混合标准溶液采用流动相逐级稀释为系列标准溶液，与样品溶液依次等体积进样。

2 结果与讨论

2.1 提取、净化及分离

从样品提取、净化及分离可以得出，动物饲料中的脂肪、蛋白以及含量较低以及磺胺类药物的弱碱性相关特点（如表1所示）。我们在本次实验过程中，工作人员主要对样品的提取主要采用的是酸性缓冲液的方式，然后在样品中加入适量的有机物质。但我们在实验的过程中考虑到质谱检测器具有较强选择性的特点，因此实验对提取液采用的净化方式为HLB柱。

图1可以看出，10种磺胺类药物在时间为11min内均得到了较好的分离，并且具有较好的峰形。除此之外对各种磺胺类药物的同分异构体可结合保留时间进行定性。并且配合饲料的总离子流色谱图中背景基线稳定，未出现干扰的状况。10 种磺胺类药物标准品混合物的总离子流色谱图如图1所示：

图1 10 种磺胺类药物标准品混合物的总离子流色谱图

2.2 参数设定

在本次试验中发现，当色谱流动相的醋酸铵浓度在10mmol/L以上时，将会明显地抑制电离反应。因此，在实验的过程中应该在尽可能地降低流动相中的盐浓度，如此便能有效地确保磺胺类药物在浓度为1mmol/L的醋酸铵缓冲盐中达到足够的灵敏度。工作人员可以采用串联质谱MRM信号的采集方式对动物饲料中多磺胺类药物进行分析，分别进行Q1母离子扫描以及Q3子离子全扫描，如此便能有效地确定MRM的特征，并根据此结果对离子进行诊断。

表1 磺胺类药物产生的离子碎片

根据表1我们可以得出，10 种磺胺类药物具有共同的碎片离子157及109，它们是相对丰度较高的离子对。在选择MRMQ1/Q3对离子进行诊断的过程中，需要尽可能地避开背景对检测过程和检测结果造成的干扰。如 SM2与仪器管路中常见的背景离子邻苯二甲酸酯的分子离子峰恰好相同，均为280，且实验表明很多水产养殖用饲料也含有 279/204 的背景离子对信号。因此磺胺类药物的侧链R基团不同时，产生共同碎片的最优碰撞能量也将存在差异。在MRM模式下磺胺类药物特征诊断离子如表2所示：

表2 MRM模式下磺胺类药物特征诊断离子

2.3 回收率及精密度

当磺胺类药物添加水平为1.0mg/kg时，经过提取、MHN柱净化等过程后，10 种磺胺类药物的平均回收率在70%～92%之间，且日内相对标准偏差在10%以内，日间相对标准偏差在15%以内，因此适用于饲料多磺胺组的分析。回收率及精密度如表3所示：

表3 回收率及精密度[n=5，（x±s）]

[1]秦燕，张美金，林海丹，等.高效液相色谱-电喷雾串联质谱法测定动物饲料中的10种磺胺[J].色谱，2012，23（4）：397-400.

[2]唐姝，陈娟，高建龙，等.饲料中磺胺氯吡嗪钠含量的高效液相色谱检测方法的建立[J].南京农业大学学报，2012，35（2）：105-109.

[3]周波，孟庆翔，周振明，等.高效液相色谱法同时测定饲料中9种磺胺药物[J].饲料研究，2012，22（12）：42-45.

[4]贾涛.高效液相色谱法同时检测饲料中6种磺胺类药物的探讨[J].饲料广角，2012，09（15）：34-38.

[5]秦燕，张美金，林海丹，等.饲料中八种磺胺药物的高效液相色谱测定[J].分析测试学报，2014，23（4）：88-91.

[6]严丽娟，张峰，方恩华，等.超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法测定动物饲料中的大环内酯类和林可胺类抗生素[J].色谱，2010，28（11）：1038-1042.

[7]吴强，何生虎，陈娟，等.超高效液相色谱-串联质谱法测定牛羊肉中7种β-内酰胺类抗生素的残留量[J].动物医学进展，2015，36（6）：64-68.

薛瑞婷（1988-），女，硕士研究生，助教，动物营养。

项目名称：吕梁学院校内基金。ZRXN201411 铅对蟾蜍蝌蚪生长发育的毒性效应。