超高效液相色谱-串联质谱法测定饲料中的恩诺沙星和喹乙醇药物的含量

■李洪波 许小友 黄志伟 刘利晓 罗志忠

（驻马店市畜牧局，河南驻马店 463000）

恩诺沙星（Enrofloxacin）又名乙基环丙沙星，是第三代喹诺酮类（Quinolones，QNs）抗菌药，具有抗菌谱广、杀菌作用强、副作用小，与其他抗菌药物交叉耐药等特点，广泛应用于兽医临床[1]。但是不合理使用恩诺沙星导致细菌耐药性增加[2]，严重威胁人体健康。喹乙醇（Olaquindox）又名喹酰胺醇，属于喹噁啉类药物，是一类喹噁啉-1,4-二氧化物，能抗菌，促进蛋白质同化，增加瘦肉率而被广泛使用[3]。但是毒理学研究表明，喹乙醇具有致癌、致畸等毒性[4]。饲料生产过程中非法添加和养殖者在养殖过程中违规使用的现象时有发生，因此为保证动物饲料安全，进而保障畜禽产品质量安全，有必要建立恩诺沙星和喹乙醇检测方法。目前，关于恩诺沙星和喹乙醇的液相色谱串联质谱检测法分别都有报道[5-8]，但同时检测恩诺沙星和喹乙醇的高效液相串联质谱检测分析法未见报道。本文建立了同时检测恩诺沙星和喹乙醇的超高效液相色谱质谱联用的分析方法。该方法灵敏度高，选择性好，为快速、严格地检测监管饲料中恩诺沙星和喹乙醇的违规使用和非法添加情况提供技术保障。

1 材料和方法

1.1 仪器

Acquit UPLC-Xevo TQ-S质谱联用仪（Waters公司）；3-30k台式高速冷冻离心机（Sigma公司）；TTLDCⅡ氮吹仪（北京同泰科技发展有限公司）；IKAMS3.Basic圆周振荡器（广州仪科实验室技术有限公司）；AG125电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；VX-Ⅲ多管涡旋振荡器（北京踏锦科技有限公司）；Waters Oasis HLB固相萃取柱（3CC/60 mg）。

1.2 试剂

甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯；柠檬酸、磷酸氢二钠、乙二胺四乙酸二钠、氢氧化钠均为分析纯；试验用水为经mili-Q净化系统制备的去离子水；恩诺沙星、喹乙醇购于中国兽医药品监察所。

Mcllvaine-Na2EDTA缓冲液：分别称取柠檬酸12.9 g、磷酸氢二钠10.9 g、乙二胺四乙酸二钠37.2 g，加水900 ml溶解，用1 mol/l氢氧化钠溶液调节pH值至4.0±0.5，加水稀释至1 000 ml，即得。

1.3 标准贮备液的配制

分别精密称取恩诺沙星和喹乙醇各约10 mg，置于10 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释成约1 mg/ml的标准贮备液。于-20℃下避光保存，然后用30%乙腈逐步稀释成适当浓度的混合标准工作液。

1.4 样品前处理

1.4.1 样品提取

称取饲料试样2.00 g（精确到0.01g），置于50 ml离心管内，加1%甲酸-乙腈（20∶80，V/V）10 ml，涡旋混匀2 min，超声10 min，10 000 r/min离心5 min，转移上清液于另一50 ml离心管内。将余下部分重复提取一次，合并提取液。准确量取提取液5ml于10 ml试管中，50℃氮气吹至约1 ml，加入Mcllvaine-Na2EDTA缓冲液2 ml，涡旋混匀1 min，为待净化溶液。

1.4.2 样品净化

取HLB固相萃取柱，依次用3 ml甲醇和3 ml Mcllvaine-Na2EDTA缓冲液活化。待净化液全部过柱，依次用3 ml水和3 ml 5%甲醇淋洗，挤干。用3 ml甲醇洗脱，收集洗脱液，50℃氮气吹干，加入1 ml 30%乙腈水溶液溶解成净化液，稀释10倍后（取净化液0.1 ml，加入30%乙腈水溶液0.9 ml），过0.22 μm滤膜后供超液相色谱-串联质谱检测。

1.5 方法

1.5.1 色谱条件

色谱柱：Waters Acquity UPLCTMBEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；柱温：40 ℃；流动相A：0.1%甲酸溶液，B：乙腈；进样量：2 μl；梯度洗脱程序见表1。

表1 色谱梯度洗脱程序

1.5.2 质谱条件

电喷雾离子源；正离子扫描；多反应监测MRM；离子源温度：150℃；雾化温度：500℃；雾化器流速：1 000 L/Hr；锥孔气流速：150 L/Hr；毛细管电压：2.5 kV；定性、定量离子对及对应的锥孔电压和碰撞能量见表2。

表2 恩诺沙星和喹乙醇定性、定量离子及对应的锥孔电压和碰撞能量

2 结果

2.1 线性关系

精密吸取200 μg/l的标准混合中间液0.025、0.05、0.10、0.20、0.50 ml于1.5 ml离心管中，分别加入0.1 ml空白净化液，分别加入30%乙腈水溶液溶0.88、0.85、0.80、0.70、0.40 ml，涡旋混匀，从而配制成5、10、20、50、100 μg/l的系列标准溶液，并依次上机，以各化合物的质量浓度为横坐标，定量离子的质量色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线（见表3），可以看出7种化合物在5～100 μg/l范围内呈现出良好的线性关系，相关系数均在0.998 0以上。

表3 恩诺沙星和喹乙醇的标准曲线及相关系数

2.2 检测限和定量限

向空白饲料试样中添加适量的混合标准溶液，经处理上机。根据特征质量色谱峰的信噪比S/N＞3为检测限，S/N＞10为定量下限，检测到恩诺沙星、喹乙醇的检测限为0.05 mg/kg，定量下限为0.1 mg/kg。

2.3 方法的灵敏度和准确度

分别在配合饲料、预混合饲料、浓缩饲料中添加0.1、0.2、0.5 mg/kg的混合标准物进行回收率试验，每个浓度做5个平行，连续做3批，其平均回收率、批内(批间)变异系数见表4、表5、表6。恩诺沙星的回收率在80%～90%之间，喹乙醇的回收率在70%～90%，批内批间的相对偏差均小于20%。恩诺沙星和喹乙醇在空白配合饲料中空白色谱图见图1，空白配合饲料添加色谱图见图2。

表4 配合饲料中恩诺沙星和喹乙醇的回收率及RSD(n=5)

表5 预混合饲料中恩诺沙星和喹乙醇的回收率及RSD(n=5)

表6 浓缩饲料中恩诺沙星和喹乙醇的回收率及RSD(n=5)

该试验方法灵敏度较好，准确度高，满足《兽药残留试验技术规范》的相关要求。

3 讨论与小结

3.1 色谱条件的优化

恩诺沙星具有两性基团，属于酸碱两性化合物，在水溶液中以离子形式存在，通常选用酸性溶液作为流动相组成成分[9]。喹乙醇已有报道，采用甲醇-水和乙酸-乙腈作为流动相系统[10]。在使用ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm，粒径1.7 μm)作为色谱柱条件下，分别尝试了甲酸、乙酸、甲醇、乙腈多种配比流动相条件，结果发现用0.1%甲酸-乙腈作为流动相能获得较好的峰型和较高的响应。

3.2 质谱条件的优化

首先分别将恩诺沙星（100 ng/ml）和喹乙醇（200 ng/ml）标准溶液流动注射进样，以正离子模式进行一级质谱图扫描，发现这些药物的[M+H]+峰均比较强，故选择[M+H]+作为母离子。然后进行子离子扫描，最终分别选择响应值较高的两个子离子作为定性和定量离子，并优化锥孔电压和碰撞能量等质谱参数，使其相应的响应值达到最大。

3.3 样品前处理条件的优化

由于饲料样品中基质成分比较复杂，油脂类成分含量高，提取目标化合物带有碱性基团，故采用酸化有机提取溶液。经过多次试验最终确定用1%甲酸-乙腈（20∶80，V/V）溶液作为提取液回收率最好。固相萃取柱的选择对样品溶液的净化，进而减轻基质效应至关重要。本文分别对MCX、PCX、C18和HLB固相萃取柱进行了考察，结果发现HLB柱回收率较高，批内变异系数相对较小，最终选择HLB柱作为净化柱。同时对淋洗条件进行了优化，结果发现单独使用水和5%甲醇淋洗都有较大的基质干扰，采用10%甲醇淋洗，恩诺沙星和喹乙醇的的回收率明显降低；因此采用依次用水和5%甲醇淋洗，甲醇洗脱，最终得到了满意的试验结果。

图1 空白配合饲料恩诺沙星和喹乙醇特征离子质量色谱图

图2 空白配合饲料中添加0.2 mg/kg的恩诺沙星和喹乙醇特征离子质量色谱图

由于不同种类的饲料其组成成分不同，导致样品溶液的基质不同，从而在仪器检测过程中产生本不同的基质效应。本研究采用同种空白饲料做添加回收试验能得到满意结果，但不同种类空白饲料偏差较大。本研究将恩诺沙星和喹乙醇作为目标化合物进行试验探索，同时优化样品前处理条件、色谱条件和质谱条件，从而建立了饲料中同时检测恩诺沙星和喹乙醇的UPLC-MS/MS方法，并且其准确度和灵敏度能满足饲料检测的需要。恩诺沙星和喹乙醇是喹诺酮类和喹噁啉类药物的典型代表。该方法的建立为喹诺酮类和喹噁啉类更多药物同时进行UPLC-MS/MS检测的方法研究奠定基础，具有一定的创新性和参考价值。