液相色谱-串联质谱法测定尿酸及与常规检测方法的比较

张海晨，　李水军，　孙贺伟，　宋云霄

[1. 上海市徐汇区中心医院(中国科学院上海临床研究中心)检验科，上海 200031；

2. 上海市徐汇区中心医院(中国科学院上海临床研究中心)中心实验室，上海 200031；

3. 上海大学生命科学学院，上海 200444]

液相色谱-串联质谱法测定尿酸及与常规检测方法的比较

张海晨1，李水军2，孙贺伟3，宋云霄1

[1. 上海市徐汇区中心医院(中国科学院上海临床研究中心)检验科，上海 200031；

2. 上海市徐汇区中心医院(中国科学院上海临床研究中心)中心实验室，上海 200031；

3. 上海大学生命科学学院，上海 200444]

摘要：目的建立液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测血清尿酸的方法，并与临床常规生化方法进行比较，为临床实验室不同检测系统尿酸检测结果的一致性提供参考。方法血清添加同位素内标尿酸-15N2，经乙腈处理吹干重组后采用LC-MS/MS测定。以Capcell C18 MGⅢ为分析柱进行反相色谱分离，以5 mmol/L乙酸铵+0.1%乙酸水溶液和甲醇(90∶10，v/v)为流动相，等度洗脱，流速0.3 mL/min，电喷雾离子化串联四极杆质谱，负离子多反应监测，尿酸离子通道为167/124 amu(定量)、167/96 amu(定性)；尿酸-15N2离子通道为169/125 amu。LC-MS/MS进行方法学评价后与临床尿酸常规检测方法(酶紫外法和酶比色法)进行比较。结果LC-MS/MS检测尿酸的线性范围为30～952 μmol/L，批内和批间精密度分别为2.01%～6.23%和4.55%～8.08%，准确度为96.5%～103.4%。尿酸的色谱保留时间为1.5 min，单份样品的分析时间为3 min。酶紫外法、酶比色法与LC-MS/MS的平均偏差分别为-10.02%、-9.88%；线性相关方程分别为Y酶紫外法=0.898XLC-MS/MS+2.15，r=0.978；Y酶比色法=0.845XLC-MS/MS+22.15，r=0.983。LC-MS/MS与美国标准技术研究所(NIST)定值参考物质的平均偏差为1.56%±0.65%，与卫生部临床检验中心2014年代谢物正确度验证样品的定值的偏差为-0.34%～3.05%。结论采用LC-MS/MS可简便、准确地定量检测尿酸。酶紫外法、酶比色法的血清尿酸测定结果与LC-MS/MS具有较好的可比性。

关键词：尿酸；液相色谱-串联质谱法；尿酸酶紫外法；尿酸酶比色法

Liquid chromatography-tandem mass spectrometry for uric acid and its comparison with clinical routine determination methodZHANGHaichen1，LIShuijun2，SUNHewei3，SONGYunxiao1

.[1.DepartmentofClinicalLaboratory，ShanghaiXuhuiCentralHospital(ShanghaiClinicalResearchCenter，ChineseAcademyofSciences)，Shanghai200031，China； 2.CentralLaboratory，ShanghaiXuhuiCentralHospital(ShanghaiClinicalResearchCenter，ChineseAcademyofSciences)，Shanghai200031，China； 3.BiologicalCollege，ShanghaiUniversity，Shanghai200444，China]

Abstract：ObjectiveTo establish a liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS)for serum uric acid， and to compare LC-MS/MS with clinical routine determination methods. MethodsUric acid-15N2was added as internal standard， serum samples were precipitated with acetonitrile and dried with nitrogen flow. A reversed-phase chromatographic separation was performed on Capcell C18 MGⅢ analytical column by using 5 mmol/L ammonium acetate plus 0.1% acetate acid in water and methanol(90∶10，v/v)as mobile phase. The flow rate was 0.3 mL/min. Uric acid and internal standard were monitored by a negative electrospray ion-tandem mass spectrometry system using ion transitions of 167/124 amu (quantitation) and 167/96 amu (qualitation) for uric acid and 169/125 amu for uric acid-15N2. After being validated， the LC-MS/MS was compared with the uricase ultraviolet (UV) method and uricase colorimetric (UC) method. ResultsThe LC-MS/MS was validated over a concentration range of 30-952 μmol/L. Within-run and between-run precisions were 2.01%-6.23% and 4.55%-8.08%， respectively. The accuracy was 96.5%-103.4%. The retention time of uric acid was 1.5 min, and total run time was 3 min. The linear correlation formulas among LC-MS/MS， uricase UV method and uricase UC method were YUV=0.898XLC-MS/MS+2.15， r=0.978 and YUC=0.845XLC-MS/MS+22.15， r=0.983. The average biases were 1.56%±0.65% between LC-MS/MS and the National Institute of Standards and Technology (NIST) standard reference material and -0.34%-3.05% between LC-MS/MS and correctness verification samples, 2014 from the National Center for Clinical Laboratory. ConclusionsSerum uric acid can be simply and accurately measured by LC-MS/MS. There is good comparability between LC-MS/MS， uricase UV method and uricase UC method.

Key words：Uric acid； Liquid chromatography-tandem mass spectrometry method； Uricase ultraviolet method； Uricase colorimetric method

血尿酸是临床诊断痛风、肾结石的传统生化指标[1-2]。越来越多的临床研究数据表明，高尿酸血症还是高血压、冠心病、代谢综合征的风险因子[3-7]。低尿酸血症则可能增加恶性肿瘤、心血管疾病、骨损伤疾病、胆囊疾病的风险[8]。目前用于检测尿酸的方法有酶紫外法、酶比色法、磷钨酸比色法、干化学法等。基于质谱法的尿酸检测更多地应用于参考方法的建立[9-11]，用于临床常规检测则比较少见。我们对本实验室自建的同位素稀释液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)进行了方法学验证，并与目前临床常用的检测尿酸的酶紫外法和酶比色法进行比较，评价LC-MS/MS与现有尿酸检测方法的可比性。

材料和方法

一、样品来源

收集上海市徐汇区中心医院门诊及住院的血清尿酸>476 μmol/L和<100 μmol/L的患者45例。同时收集上海市徐汇区中心医院体检中心健康体检者135名，其中男65名，女70名，排除明显溶血和脂浊的样本，体检结果无明显异常。所有血清样本收集后置-70℃保存。

二、试剂和仪器

1. 试剂尿酸标准品(纯度99%，批号10105129)购自英国Alfa Aesar公司；尿酸-15N2(同位素丰度98%，批号PR-16532A)购自美国Cambridge Isotope Laboratory公司；乙酸(液相色谱纯)购自美国Tedia公司；乙酸铵(优级纯)、乙腈(液相色谱纯)、甲醇(液相色谱纯)购自德国Merck KGaA公司。尿酸常规检测试剂盒[酶紫外法(批号：FA5133)、酶比色法(批号：300196)]、校准液[酶紫外法(批号：4ED108)、酶比色法(批号：267256A)]购自西门子医学诊断产品(上海)有限公司。定值质控品(水平1批号：45651、水平2批号：45652、水平3批号：45653)购自伯乐生命医学产品(上海)有限公司。

2. 仪器LC-MS/MS检测系统由3200 QTRAP串联质谱仪(美国Applied Biosystems公司)及液相色谱系统[日本岛津公司，包括LC-20AD输液泵、DGU-20A3在线脱气仪、SIL-HTc自动进样器]组成。酶紫外法的仪器为SIEMENS Dimension RxL全自动生化分析仪检测，酶比色法的仪器SIEMENS ADVIA 2400全自动生化分析仪。其他仪器包括Vortex-2涡旋混合器、Eppendorf Centrifuge 5430 R冷冻高速离心机、Techne GR-150氮吹仪。

三、LC-MS/MS分析条件

参照文献[12]，本实验室为适应临床常规测定尿酸的需要，全新自建了LC-MS/MS，采用与文献[12]不同的流动相、洗脱方法、色谱柱和样品处理方法。

1. 液相条件分析柱为Capcell C18 MGⅢ(2.1 mm×100 mm，5 μm，日本资生堂精细化学公司)；流动相为5 mmol/L乙酸铵+0.1%乙酸水溶液和甲醇(90∶10，v/v)，等度洗脱，流速为0.3 mL/min，进样体积为5 μL。

2. 质谱条件电喷雾离子源，负离子检测；GAS1：60，GAS2：60，气帘气：20，碰撞气：高，离子源电压：4 500 V，离子源温度：550℃；多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)扫描分析，尿酸离子通道为167/124 amu(定量)、167/96 amu(定性)；尿酸-15N2离子通道为169/125 amu。

3. 贮备液、标准溶液和内标溶液的制备(1)尿酸贮备液：精密称取尿酸标准品，2 mmol/L氨水溶解定容，配制浓度为1 142 μmol/L；(2)内标贮备液：精密称取尿酸-15N2标准品，2 mmol/L氨水溶解定容，配制浓度为1 159 μmol/L；(3)尿酸工作液：取尿酸贮备液，用5 mmol/L乙酸铵+0.1%乙酸水溶液配制成浓度为30、60、119、238、476、952 μmol/L的标准工作液，按样品处理方法处理后进样。

4. 样品处理在100 μL血清中添加10 μL尿酸-15N2贮备液为内标，200 μL乙腈沉淀蛋白，22 000×g离心5 min，取50 μL上清液40℃氮气吹干，200 μL 5 mmol/L乙酸铵+0.1%乙酸水溶液重组，取5 μL进样分析。

四、尿酸常规生化检测方法

采用酶紫外法和酶比色法分别检测尿酸，严格按试剂盒说明书操作。

五、统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计分析。方法之间的差异采用配对t检验和ANOVA分析，相关性采用线性回归分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、 LC-MS/MS测定血清尿酸的方法学评价

尿酸和同位素内标的保留时间为1.5 min，每份样品的仪器分析时间为3 min。典型的色谱图见图1。采用流动相A(5 mmol/L乙酸铵+0.1%乙酸水溶液)作为空白基质，用于配制标准曲线和质控样品，空白样品无干扰。

以添加浓度为X轴，样品与内标物的峰面积比为Y轴，进行线性回归，经加权最小二乘法“1/X2”权重得回归方程为Y=0.043X+0.048，r=0.997)。尿酸浓度在30～952 μmol/L范围内线性关系良好。由于过低的尿酸浓度临床意义不大，故本研究将尿酸的最低定量下限(Lower limit of quantification，LLOQ)设定为30 μmol/L，LLOQ的色谱图见图1。LC-MS/MS的检测限可达1 μmol/L。

取6个临床血清样品，同时用空白基质(流动相A)配制297 μmol/L尿酸化学品，分别与血清样品等体积混合，重复测定6次，同时测定血清样品、化学品、混合样品的尿酸及内标响应。确定混合样品尿酸/内标比值与理论值(血清样品与化学品响应均值)的百分比即可计算方法的回收率。LC-MS/MS的回收率为93.8%～107.0%。

用空白基质配制89、297、714 μmol/L尿酸质控品，同时收集3个临床血清样品，分3个批次，每批次重复测定6次。LC-MS/MS测定血清尿酸的精密度和准确度结果见表1。

观察血样在室温(23℃)放置8 h、处理后在自动进样器放置12 h、冻融3次、-20℃保存14 d以及尿酸贮备液-20℃放置5 d的稳定性。与初始浓度相比，其相对偏差分别为-4.5%、-2.6%、-6.8%、2.1%和-0.9%。

采用 LC-MS/MS检测135名体检者的血清尿酸。男性尿酸水平[(398±70)μmol/L]明显高于女性[(303±73)μmol/L](P<0.001)，见图2。

注：尿酸及内标的色谱保留时间均为1.5 min；(a)空白基质；(b)LLOQ，尿酸浓度为30 μmol/L；(c)患者血清样品，尿酸浓度为392 μmol/L

图1　尿酸典型色谱图

图2LC-MS/MS测定男、女性血清尿酸的比较

二、方法学比较

采用LC-MS/MS、酶紫外法和酶比色法分别测定135名体检者血清尿酸浓度，经线性回归分析，回归方程分别为Y酶紫外法=0.898XLC-MS/MS+2.15，r=0.978；Y酶比色法=0.845XLC-MS/MS+22.15，r=0.983。见图3。

注：(a)LC-MS/MS与酶紫外法的相关性，Y酶紫外法=0.898XLC-MS/MS+2.15，r=0.978；(b)LC-MS/MS与酶比色法的相关性，Y酶比色法=0.845XLC-MS/MS+22.15，r=0.983

图3酶紫外法、酶比色法与LC-MS/MS的相关分析

以两种方法的尿酸测定均值为横坐标，以两种方法尿酸测定值百分偏差为纵坐标，作Bland-Altman图，分析酶紫外法、酶比色法与LC-MS/MS的一致性。酶紫外法与LC-MS/MS的平均偏差为-10.02%，酶比色法与LC-MS/MS的平均偏差为-9.88%，见图4。方差分析显示3种方法之间差异均有统计学意义(P<0.001)。

采用LC-MS/MS测定美国标准技术研究所(National Institute of Standards and Technology，NIST)参考物质SRM1950中的尿酸水平[定值±不确定度为(254±5)μmol/L)，偏差为1.56%±0.65%(n=3)；采用LC-MS/MS测定卫生部临床检验中心2014年代谢物、总蛋白正确度验证的样品[编号分别为201411、201412，定值±不确定度分别为295.0±12.0、(536.0±22.1)μmol/L)]的偏差为-0.34%～3.05%(2水平，n=3)，测定结果均落在不确定度允许范围内。测定卫生部临床检验中心2014年常规化学室间质量评价(external quality assessment，EQA)样品，与靶值的偏差为3.68%±1.19%(5水平，n=3)。

图4LC-MS/MS与酶紫外法、酶比色法的Bland-Altman图

讨论

得益于仪器成本的大幅下降和自动化程度的不断提高，最近10年质谱技术在临床检验领域的应用得到了突飞猛进的发展。LC-MS/MS将色谱的高效分离能力和质谱的特异、灵敏、多组分检测能力有机结合，成为临床检验领域最富生命力的新技术之一。目前，LC-MS/MS已经在临床检验如常规生化、内分泌、治疗药物监测、维生素、多肽蛋白等领域得到越来越广泛的应用[13]。目前基于LC-MS/MS的尿酸检测主要用于建立参考方法[9-11，14]，可以实现高度精确的尿酸检测。参考方法对分析过程和色谱分离要求严格，因此操作繁琐、时间冗长，不适合用于临床常规应用。目前鲜见LC-MS/MS用于临床常规的报道。由于上海市徐汇区中心医院药物临床试验项目及临床校对的需要，本实验室自建了测定血清尿酸的LC-MS/MS方法。本研究建立的LC-MS/MS采用同位素稀释质谱法，血清用乙腈沉淀后吹干，常规反相液相色谱分离，每个样品的色谱分析时间仅为3 min，可以实现简单、快速的检测。空白基质与真实血清有良好的互换性，样品在室温、冻融、长期储存等条件下，尿酸均能保持相对稳定。由于尿酸具有稠环化学结构，不易溶于水和有机溶剂，易溶于碱性水溶液，但尿酸在碱性条件下稳定性不佳。本研究借鉴了参考方法建立时采用的尿酸贮备液配制方法[11，15]，采用2 mmol/L氨水配制浓度1～2 mmol/L尿酸贮备液，-20℃保存，解决了其稳定性和溶解性问题。考虑到本方法为自建方法，本研究测定了NIST的参考物质SRM1950以及2014年卫生部临床检验中心代谢物正确度验证的样品，偏差总体上控制在5%以内，说明本方法具有良好的准确性和可靠性，完全可以满足尿酸常规检测的要求。

临床现有的尿酸检测方法有酶紫外法、酶比色法等多种，有进口和国产仪器/试剂之分，又存在封闭平台和开放平台等组合形式[16]。对于我国这种多样化的现状，要实现检验结果的互认最重要的前提是建立我国的参考测量体系、开展标准化工作，以实现检验结果的溯源性[17]。而进行方法学比对，特别是与参考方法进行比对，是实现检验结果一致性的重要途径[18]。本方法与酶紫外法、酶比色法的偏差平均高10%左右。总体而言，两种常规生化方法和LC-MS/MS具有较好的一致性，但是从图4可以看出，仍有约5%的低浓度样品偏差超过20%。因此，对于临床一些异常的低值结果，如条件允许，建议用LC-MS/MS复核可疑数据。另外建议参加正确度验证计划或者用参考物质进行校正，可有效提高结果的准确性和方法间的可比性。

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(本文编辑：龚晓霖)

收稿日期：(2015-01-21)

中图分类号：

文章编号：1673-8640(2015)05-0422-05R446.1

文献标志码：ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.05.004

通讯作者：李水军，联系电话：021-54031835。

作者简介：张海晨，男，1973年生，副主任技师，主要从事临床生物化学检验工作。

基金项目：上海市徐汇区卫生与计划生育委员会科研基金资助项目(SHXp01301)