弱精子症患者精子运动参数及DNA碎片化指数的检测与分析

焦瑞宝，　姚余有，　唐吉斌，　冯恒孝，　凤俊蓉

弱精子症患者精子运动参数及DNA碎片化指数的检测与分析

焦瑞宝1，姚余有1，唐吉斌2，冯恒孝2，凤俊蓉2

(1. 安徽医科大学公共卫生学院，安徽 合肥 230032; 2. 铜陵市人民医院，安徽 铜陵 244009)

摘要：目的了解弱精子症患者精子运动参数和DNA碎片化指数(DFI)的变化情况。方法通过对41例弱精子症患者(弱精子症组)和48例活力正常不育患者(活力正常组)精液的常规检测、精液分析仪检测和荧光显微镜检查，比较弱精子症组和活力正常组精液常规参数(包括精子浓度、精子总数、活动率)、精子运动参数[包括前向运动率(PR)、平均路径速率(VAP)、曲线速度(VCL)、直线速度(VSL)、直线性(LIN)、摆动性(WOB)、前向性(STR)、头侧摆幅度(ALH)、鞭打频率(BCF)和平均角位移(MAD)]及DFI。结果弱精子症组精子浓度、精子总数、活动率、PR、VAP、VCL、VSL、LIN、WOB、STR、ALH、BCF及MAD分别为(69.0±49.1)×106/mL、(203±159)×106、60.8%±15.7%、21.1%±8.0%、(10.7±2.8)μm/s、(20.6±4.9)μm/s、(6.3±2.2)μm/s、29.9%±8.1%、51.4%±5.8%、57.2%±10.4%、(0.53±0.12)μm、(3.20±0.85)Hz和(14.2±3.2)°，均明显低于活力正常组[(98.8±38.2)×106/mL(P<0.05)、(281±171)×106(P<0.05)、82.0%±7.9%(P<0.01)、45.1%±8.5%(P<0.01)、(18.5±3.0)μm/s(P<0.01)、(30.7±5.3)μm/s(P<0.01)、(12.0±2.3)μm/s(P<0.01)、39.6%±7.0%(P<0.01)、60.5%±5.0%(P<0.01)、65.1%±7.2%(P<0.01)、(0.72±0.13)μm(P<0.01)、(5.07±0.81)Hz(P<0.01)和(17.8±2.5)°(P<0.01)]；而DFI(17.9%±12.5%)明显高于活力正常组(8.5%±6.4%，P<0.01)。结论弱精子症患者除了表现为常规检查中的精子活力低下外，还伴有精子浓度和总数下降、精子运动参数下降以及精子DFI的增高，这些参数的改变可能是弱精子症引起男性不育的机制之一。

关键词：精子运动参数；DNA碎片化指数；精液常规参数；弱精子症

The detection and analysis of sperm motion parameters and DNA fragmentation index in asthenozoospermia patientsJIAORuibao1，YAOYuyou1，TANGJibin2，FENGHengxiao2，FENGJunrong2

.(1.SchoolofPublicHealth，AnhuiMedicalUniversity，AnhuiHefei230032,China; 2.TonglingPeople′sHospitalofAnhuiProvince，AnhuiTongling244009，China)

Abstract:ObjectiveTo study the changes of sperm motion parameters and DNA fragmentation index (DFI) in patients with asthenozoospermia. MethodsThe routine analysis， semen analyzer activity detection and fluorescence microzooscopy of 41 cases of asthenozoospermia patients(asthenozoospermia group) and 48 cases of normal vitality patients(normal vitality group) were performed. Semen routine parameters(sperm concentration， total number of sperm and sperm activity rate)， sperm motion parameters [progressive motility(PR)， average path velocity(VAP)， curvilinear velocity(VCL)， straight line velocity(VSL)， linearity(LIN)， wobble(WOB)， straightness(STR)， amplitude of lateral head displacement(ALH)， beat-cross frequency(BCF) and mean angular displacement(MAD)] and DFI in patients with asthenozoospermia and normal vitality group were compared. ResultsThe sperm concentration， total number of sperm， sperm activity rate， PR， VAP, VCL， VSL， LIN， WOB， STR， ALH， BCF and MAD of asthenozoospermia group were (69.0±49.1)×106/mL， (203±159)×106， 60.8%±15.7%， 21.1%±8.0%，(10.7±2.8)μm/s， (20.6±4.9)μm/s， (6.3±2.2)μm/s， 29.9%±8.1%，51.4%±5.8%， 57.2%±10.4%， (0.53±0.12)μm， (3.20±0.85)Hz and (14.2±3.2)°， respectively. These parameters were significantly lower than those of normal vitality group[(98.8±38.2)×106/mL(P<0.05)，(281±171)×106(P<0.05)， 82.0%±7.9%(P<0.01)， 45.1%±8.5%(P<0.01)， (18.5±3.0)μm/s(P<0.01)， (30.7±5.3)μm/s(P<0.01)， (12.0±2.3)μm/s (P<0.01)， 39.6%±7.0%(P<0.01)， 60.5%±5.0%(P<0.01)， 65.1%±7.2%(P<0.01)， (0.72±0.13)μm (P<0.01)， (5.07±0.81)Hz(P<0.01) and (17.8±2.5)°(P<0.01)]. The DFI in asthenozoospermia group(17.9%±12.5%) was significantly higher than that in normal vitality group(8.5±6.4%，P<0.01). ConclusionsBesides the performance of low sperm motility， asthenozoospermia is still accompanied by decreasing sperm concentration, total number of sperm and sperm motion parameters and increasing sperm DFI. The change of these parameters may be one of the mechanisms of male infertility caused by asthenozoospermia.

Key words:Sperm motion parameter; DNA fragmentation index; Semen routine parameter; Asthenozoospermia

据2011年出版的第5版《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册》规定[1]，弱精子症是指前向运动(progressive motility，PR)精子百分率低于参考区间下限(32%)的一类男性不育症，是引起男性不育最为常见的疾病之一。我们对弱精子症患者的精液进行常规检测、精液分析仪检测和荧光显微镜检查，旨在了解弱精子症患者的精子运动参数和DNA碎片化指数(DNA fragmentation index, DFI)的变化情况。

材料和方法

一、材料

1. 研究对象选取2011年9月至2014年3月铜陵市人民医院男科、不孕不育门诊以及泌尿外科的男性不育患者89例，其中弱精子症患者41例，活力正常的男性不育患者48例，两者的诊断标准均参见《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册》(第5版)[1]，排除严重少精子症、无精子症病例。

2. 仪器设备及试剂计算机辅助精子动态分析系统由南京捷达科技有限公司提供；OLYMPUX BX41荧光显微镜由日本奥林帕斯公司提供；精子核染色试剂盒由深圳华康生物医学工程有限公司提供。

3. 室内质量控制每周采用测微尺对计算机辅助精子质量分析系统进行定标，确保检测系统准确；另当精子浓度过高(>50×106/mL)时，可能会因高频度精子碰撞而产生误差，故应对高浓度标本进行稀释，即取出一定量的精液样本16 000×g离心6 min，获取无精子的精浆，用无精子精浆稀释最初的精液标本，使浓度低于50×106/mL，然后再采用计算机辅助精子质量分析系统进行测定。

二、 方法

1．标本收集所有研究对象按文献[1]要求在取精前禁欲3～5d，手淫法采集精液于干燥无菌取精杯中，30 min内保温送检，记录留取时间，60 min内完成检验。

2．精液动态分析按文献[1]要求操作，将送来的精液标本置37℃水浴箱中，观察液化状态及液化时间，并记录精液体积。取充分混匀的精液5～10 μL置于精子计数盘中，采用计算机辅助精子动态分析系统进行检测，包括精子浓度、精子活动率、精子运动速度参数[平均路径速率(average path velocity, VAP)、曲线速度(curvilinear velocity, VCL)、直线速度(straight line velocity, VSL)]以及精子运动轨迹特征参数[包括直线性(linearity, LIN)、摆动性(wobble, WOB)、前向性(straightness, STR)、头侧摆幅度(amplitude of lateral head displacement, ALH)、鞭打频率(beat-cross frequency, BCF)和平均角位移(mean angular displacement, MAD)]。

3．精子DFI的测定精液液化并计数，取液化精液1.0 mL加于离心管内，1 000×g离心5 min，去除精浆；加1 mL稀释洗涤液，充分混匀，500×g离心5 min，去上清液，如此洗涤3次；最后1次洗涤完毕，弃上清液，用稀释洗涤液调整精子浓度为20×106/mL。取5～10 μL悬浮液于清洁载玻片上涂片，晾干，滴加数滴乙醛固定液固定10 min，后将玻片直立于吸水纸上以除去固定液；滴加数滴新鲜配制的吖啶橙工作液染色5 min，流水冲洗，晾干；荧光显微镜下观察(激发滤光片波长460～490 nm)，每个视野观察时间不超过40 s。利用吖啶橙异染性，吖啶橙与双链DNA结合发出绿色荧光，与单链DNA结合发出红色或黄色荧光，计数200条精子中绿色、红色和橙黄色精子数。计算出红色、橙黄色荧光精子的百分率，即为精子DFI[2]。

三、统计学方法

结果

弱精子症组和活力正常组之间年龄和精液量差异无统计学意义(P>0.05)。弱精子症组精子浓度、精子总数、精子活动率和PR均明显低于活力正常组(P<0.05、P<0.01)，DFI (17.9%±12.5%)明显高于活力正常组(8.5%±6.4%；t=4.33,P<0.01)。见表1。

弱精子症组精子运动速度参数(包括VAP、VCL、VSL)、前向性运动参数(包括LIN、WOB、STR)及运动轨迹特征参数(包括ALH、BCF、MAD)均明显低于活力正常组(P均<0.01)。见表1。

表1　弱精子症组与活力正常组精液质量参数、精子运动参数及运动轨迹特征参数的比较　)

讨论

引起男性不育症的原因很多，包括无精子症、弱精子症、少精子症和畸形精子症等，弱精子症是最为常见病因之一。引起弱精子症的原因很多，常见有精索静脉曲张、睾丸炎、隐睾、附属性腺感染以及年龄、基因异常、环境污染物影响等。弱精子症的诊断标准近年来也在变化，2001年《世界卫生组织人类精液及精子-宫颈粘液相互作用实验室检验手册》[3](第4版)规定：射精后60 min内，前向运动精子少于50%或者快速前向运动精子少于25%则判断为弱精子症；而2011年第5版的《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册》规定：前向运动精子低于32%为弱精子症[1]。从两者的诊断标准可以判断，PR明显下调，降低了标准。弱精子症的诊断主要依赖于不育患者的精液实验室分析，早年精液分析由人工完成，主要进行精液量、精子计数、精子活动力、精子活动率和是否液化等方面的检测，从而判断正常与否。人工检测的影响因素多，结果准确性差。近20年来，伴随着计算机技术、显微镜技术和图像处理技术的发展，利用计算机辅助的精子质量检测系统在国内得到大力发展和推广，目前已经成为各级各类医疗机构用于精液分析的主要仪器设备。计算机辅助精子质量分析系统(computer-aid sperm analysis，CASA)可进行精子浓度计数、活力分级，特别是在精子微细运动的测算与评价方面具有传统手工检测无法比拟的优势，可得到十几项运动参数[4]。

精子DFI是近些年受到广泛关注的一项反映精子染色质结构的参数，精子运动速度参数(VAP、VCL和VSL)是反映精子活力的重要参数，精子前向运动能力下降主要体现在精子运动速度的降低[5]。袁平庆等[6]在对体外受精的研究中发现，高受精率组VAP、VCL和ALH均高于低受精组。精子具有正常活动力是保证到达输卵管、使卵子受精的一项基本条件[7]。

本研究结果显示，弱精子症组年龄和精液量与活力正常组比较差异无统计学意义(P>0.05)；而精子活动率、浓度、总数、PR和运动参数(包括VAP、VCL、VSL、ALH、BCF、MAD、LIN、WOB和STR)均明显低于活力正常组(P<0.05、P<0.01)；精子DFI明显高于活力正常组(P<0.01)，与文献报道[8-10]一致。

综上所述，弱精子症患者除了精子活力低下外，还伴有精子浓度及总数下降，精子运动速度和运动特征参数全面下降以及精子DFI增高，这些参数的改变可能是弱精子症引起男性不育的机制之一。

参考文献

[1]世界卫生组织. 世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册[M].5版.北京：人民卫生出版社，2011：193.

[2]焦瑞宝，冯恒孝，唐吉斌，等.不育患者精液的氧化应激对精子DNA完整性等参数的影响[J].检验医学，2013,28(6)：487-491.

[3]世界卫生组织. 世界卫生组织人类精液及精子-宫颈粘液相互作用实验室检验手册[M].4版，北京：人民卫生出版社，2001：51.

[4]马晓萍，高晓勤，杨燕平，等.不育患者精浆中性α-1,4-糖苷酶活性与精液参数及精子透明质酸酶活性的关系[J].检验医学，2014,29(1)：53-56.

[5]YOUN JS，CHA SH，PARK CW，et al. Predictive value of sperm motility characteristics assessed by computer-assisted sperm analysis in intrauterine insemination with superovulation in couples with unexplained infertility[J]. Clin Exp Reprod Med，2011，38(1): 47-52.

[6]袁平庆，张哲欢，罗琛，等.计算机辅助精液分析精子运动参数在体外受精中的应用[J]. 南方医科大学学报，2013，33(3)：448-450.

[7]GUO J，ZHAO Y，HUANG W，et al. Sperm motility inversely correlates with seminal leptin levels in idiopathic asthenozoospermia[J]. Int J Clin Exp Med, 2014，7(10):3550-3555.

[8]许金榜，黄海龙，康跃凡，等. 男性少弱精子症不育患者精子DNA 碎片检测情况分析[J]. 中国现代医学杂志，2013，23(23)：75-78.

[9]COHEN-BACRIE P，BELLOC S，MÉNÉZO YJ，et al. Correlation between DNA damage and sperm parameters: a prospective study of 1 633 patients[J]. Fertil Steril，2009，91(5): 1801-1805.

[10]何江，余伍忠，邹红云. 计算机职业对男性不育患者精子动力学参数和精子活力的影响及其相关性研究[J]. 中国优生与遗传杂志，2010，30(5)：110-111.

(本文编辑：范基农)

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收稿日期：(2014-12-16)

中图分类号：

文章编号：1673-8640(2015)05-0442-04R446.11

文献标志码：ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.05.008

通讯作者：姚余有，联系电话：0551-63869179。

作者简介：焦瑞宝，男，1974年生，硕士，副主任技师，主要从事临床检验、教学及科研工作。

基金项目：铜陵市科技计划项目(2013NS07)；铜陵市卫生局科研项目(卫科研[2013]15号)