子宫内膜异位症患者腹腔液单个核细胞Fas的表达及意义

刘洪正，　王玉亮

子宫内膜异位症患者腹腔液单个核细胞Fas的表达及意义

刘洪正1，王玉亮2

(1. 天津市滨海新区汉沽中医医院检验科，天津 300480；

2. 天津市第一中心医院检验科卫生部危重病急救医学重点实验室，天津 300192)

摘要：目的探讨子宫内膜异位症与Fas介导的腹腔液单个核细胞凋亡的关系。方法选取手术后病理证实为子宫内膜异位症的患者55例作为子宫内膜异位症组，以非子宫内膜异位症患者52例作为对照组，分离腹腔液单个核细胞，应用实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定Fas mRNA的表达水平，应用流式细胞术定量检测Fas表达细胞百分率。结果子宫内膜异位症组腹腔液单个核细胞Fas mRNA及Fas表达细胞百分率明显高于对照组(P<0.05)，Fas mRNA及Fas表达细胞百分率在子宫内膜异位症组Ⅰ～Ⅱ期与Ⅲ～Ⅳ期中表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论子宫内膜异位症患者腹腔液单个核细胞Fas表达异常，对子宫内膜异位症具有一定的作用。

关键词：Fas；单个核细胞；腹腔液；子宫内膜异位症

Expression of Fas in peritoneal fluid mononuclear cells among endometriosis patients and its significanceLIUHongzheng1，WANGYuliang2

.(1.DepartmentofClinicalLaboratory,HanguChineseMedicineHospitalofTianjinBinhaiNewArea,Tianjin300480,China; 2.DepartmentofClinicalLaboratory,TianjinFirstCentralHospital,KeyLaboratoryforCriticalCareMedicineoftheMinistryofHealth,Tianjin300192,China)

Abstract:Objective To investigate the relationship of Fas expression in peritoneal fluid mononuclear cells and endometriosis. MethodsA total of 55 patients with histopathologically diagnosed endometriosis after operation were enrolled as endometriosis group, and 52 patients without endometriosis were enrolled as control group. The peritoneal fluid mononuclear cells were isolated, the expression levels of Fas mRNA were determined by reverse transcriptase-polymerase chain reaction(RT-PCR), and the percentage of Fas expression cells were quantitatively detected by flow cytometry. ResultsFas mRNA and the percentage of Fas expression cells were significantly higher in endometriosis group than those in control group(P<0.05). There was no statistical significance between stage Ⅰ-Ⅱand stage Ⅲ-Ⅳ(P>0.05). ConclusionsThe abnormal Fas expression in peritoneal fluid mononuclear cells may play an important role in endometriosis.

Key words:Fas; Mononuclear cell; Peritoneal fluid; Endometriosis

细胞凋亡是机体清除感染、变异、衰老的细胞，维持自身正常生理平衡的一种调节方式。Fas/FasL是引起细胞凋亡的重要通路之一，也是杀伤性T淋巴细胞杀伤靶细胞的三大途径之一[1]。Fas/FasL系统对于正常人体的发育、器官分化、免疫调节等一系列重要生理功能都是必不可少的，其异常与肿瘤、自身免疫疾病、移植排斥等发生、发展有密切关系[2-4]。子宫内膜异位症多发生于育龄期妇女，近年来发病有明显上升趋势[5]，其发病机制尚不明确。近年研究发现，子宫内膜异位症患者与正常人内膜细胞的凋亡率存在显著差异，异位的子宫内膜细胞表现过度增殖及凋亡异常可能是子宫内膜异位症发生、发展的重要原因之一[6]。我们通过检测子宫内膜异位症患者腹腔液单个核细胞Fas的表达水平，探讨Fas介导的腹腔液单个核细胞凋亡在子宫内膜异位症发病中的作用。

材料和方法

一、材料

1. 研究对象选取2010至2014年上半年在天津市滨海新区汉古中医院、天津市第一中心医院妇科行腹腔镜或开腹手术并术后经病理证实的子宫内膜异位症患者55例作为子宫内膜异位症组，平均年龄(36±6)岁；用修订后的美国生育协会内异症分期评分法对子宫内膜异位症组患者进行分期，38例为Ⅰ～Ⅱ期(轻度内异症组)，17例为Ⅲ～Ⅳ期(重度内异症组)。选取同期住院行腹腔镜手术的非子宫内膜异位症患者52例作为对照组，无盆腔炎症，平均年龄(34±6)岁。两组采样前3个月均未接受激素类药物治疗，年龄差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经医院伦理委员会批准，患者进行知情告知并签署知情同意书。

2. 标本收集子宫内膜异位症组与对照组于术中无菌吸取子宫直肠陷凹处的腹腔液，注意操作时避免血液流入腹腔，有血液污染则弃去不用，分别分离出腹腔液单个核细胞。

3. 试剂与仪器总RNA抽提试剂TRIzol(美国GIBCO-BRL公司)，AMV逆转录酶(美国Promega公司)，聚蔗糖-泛影葡胺淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)，Fas、β-actin引物序列(美国Applied Biosystems公司)，异氰酸荧光素(FITC)-小鼠抗人Fas单克隆抗体(美国Becton Dickinson公司)，ABI 7300 PCR扩增仪(美国ABI公司)，FACS Calibur流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)。

二、方法

1. 腹腔液单个核细胞表面Fas分子的定量检测[7]将采集的腹腔液经淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，加入荧光素异氰酸荧光素(FITC)-小鼠抗人Fas单克隆抗体，孵育30 min，用PBS洗涤2次后制成悬液，采用流式细胞术测定并计算Fas表达细胞的百分率。

2. 腹腔液单个核细胞FasmRNA的检测采用实时逆转录荧光定量PCR测定FasmRNA。采用TRIzol法提取细胞总RNA，按逆转录酶说明书操作合成cDNA。Fas上游引物序列：5′-AAGACTGTTACTACAGTTG-3′，下游引物序列：5′-GCTTATGGCAGAATTGGCCA-3′；β-actin上游引物序列：5′-GATGGCCACGGCTGCTT-3′，下游引物序列：5′-ACCGCTCATTGCCAATGGT-3′；实时荧光PCR扩增：反应体系为10×PCR缓冲液2.5 μL，dNTP 0.5 μL，20×SYBR Green Ⅰ液1 μL，Taq酶1 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA模板2 μL，加去离子水至25 μL。反应条件为93℃ 2 min，然后93℃ 60 s，50℃ 60 s，72℃ 60 s，40个循环；72℃延伸10 min。为消除标本处理、逆转录和PCR的差异，以2-ΔCt表示Fas mRNA的相对表达水平,其中ΔCt=CtFas-Ctβ-actin。

三、统计学方法

结果

一、子宫内膜异位症组和对照组腹腔液单个核细胞FasmRNA及Fas表达细胞百分率的比较

子宫内膜异位症组腹腔液单个核细胞FasmRNA的表达水平及Fas表达细胞百分率均明显高于对照组(P均<0.05)，见表1。

二、子宫内膜异位症Ⅰ～Ⅱ期与Ⅲ～Ⅳ期腹腔液单个核细胞FasmRNA表达水平及Fas表达细胞百分率的比较

Ⅰ～Ⅱ期子宫内膜异位症患者腹腔液单个核细胞FasmRNA表达水平及Fas表达细胞百分率与Ⅲ～Ⅳ期患者比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1　两组腹腔液单个核细胞Fas mRNA

注：与对照组比较，*P<0.05

讨论

子宫内膜异位症是一种常见良性却有恶性行为的妇科疾病，近年来发病有明显上升趋势[8]。研究证实子宫内膜异位症发生与细胞免疫密切相关，主要表现在巨噬细胞、自然杀伤细胞、杀伤性T淋巴细胞对于异位内膜细胞的杀伤活性降低，从而降低了机体对异位子宫内膜的免疫监视、识别和破坏，不能有效阻止异位内膜细胞在腹腔中的种植及生长，促进了内膜异位病灶的形成[9]。

Fas是一种相对分子质量为48 000的 Ⅰ型跨膜糖蛋白，属于肿瘤坏死因子受体超家族成员之一，为介导细胞凋亡的重要膜表面死亡分子。FasL为Fas的配体。当免疫活性细胞表面的膜分子FasL与靶细胞上的Fas结合后，启动凋亡信号的跨膜传递，Fas分子胞浆段内的死亡结构域与Fas死亡结构域相关蛋白结合，并激活天门冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)8，形成死亡诱导信号复合物，进而导致caspase3的激活和一系列的级联反应，从而启动表达Fas细胞的凋亡[10]。

近年研究发现，子宫内膜异位症患者内膜细胞与正常人内膜细胞凋亡率有明显差异，常伴有异位内膜细胞Fas表达缺失、异位内膜细胞凋亡降低以及腹腔淋巴细胞凋亡升高[11]。本研究结果显示子宫内膜异位症患者腹腔液单个核细胞FasmRNA及Fas表达细胞百分率明显升高，但与临床分期无关。当这些表达Fas的免疫细胞与表达FasL的异位内膜细胞结合后，可能会激活Fas/FasL凋亡信号传导途径，进而使高表达Fas的免疫细胞发生凋亡，从而影响了微环境的免疫防御机制。因此，免疫细胞无法杀伤内膜增生细胞，为异位内膜细胞的种植和生长提供有利条件，使逆流至腹腔中的内膜细胞逃避免疫杀伤而易于存活[12]。而表达FasL的腹腔液淋巴细胞也可通过旁分泌形式导致相邻的Fas阳性淋巴细胞凋亡，也可通过自分泌形式自杀，使免疫监视、免疫杀伤功能减弱而不能有效地清除异位内膜细胞。因此，Fas/FasL引起的腹腔液免疫细胞凋亡可能在子宫内膜异位症发生、发展中起重要作用。

参考文献

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(本文编辑：储怡星)

收稿日期：(2014-12-12)

中图分类号：

文章编号：1673-8640(2015)05-0454-03R446.1

文献标志码：ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.05.011

通讯作者：王玉亮，联系电话：022-23728992。

作者简介：刘洪正，男，1966年生，主管技师，主要从事临床免疫检验工作。