不同基因型的鲍曼不动杆菌耐药性及体外黏附能力差异的研究

塔　拉，　王俊瑞，　崔晶花，　杜小莉，　杨丽敏，　孙　鹏，　魏常梅，　张军力

不同基因型的鲍曼不动杆菌耐药性及体外黏附能力差异的研究

塔拉1，王俊瑞2，崔晶花3，杜小莉3，杨丽敏4，孙鹏4，魏常梅1，张军力2

(1. 内蒙古医科大学，内蒙古 呼和浩特 010110；

2. 内蒙古医科大学附属医院检验科，内蒙古 呼和浩特 010050；

3. 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所， 北京 102206；

4. 内蒙古医科大学病原生物学研究中心，内蒙古 呼和浩特 010059)

摘要：目的对不同基因型鲍曼不动杆菌的耐药特征及体外黏附能力进行分析，为进一步阐明鲍曼不动杆菌耐药性变迁与其黏附能力变化之间的相关性及指导鲍曼不动杆菌感染防控和治疗提供试验依据。方法采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)对从内蒙古不同地区住院患者体内分离的具有不同耐药性的50株鲍曼不动杆菌进行分子分型；采用纤维黏连蛋白黏附试验对不同基因型分离株的体外黏附能力进行检测。结果50株鲍曼不动杆菌共分为22个PFGE基因型，其中A和E型为优势型，分别占22%(11/50)和24%(12/50)；L型对所有受试的抗菌药物均耐药，其余基因型耐药表型差异明显。从地区分布来看，A型主要分布在兴安盟和赤峰市2个地区，而E型则分布在呼和浩特地区。体外黏附能力最强的菌株属于G型和J型，其中J型对所有抗菌药物均敏感；黏附能力最弱的菌株为D型，仅对碳青霉烯类药物敏感。结论内蒙古地区鲍曼不动杆菌的基因型呈现多样性，具有明显的地域分布特征，特定基因型菌株具有相同或相近的耐药特征。鲍曼不动杆菌耐药性的增加与其体外黏附能力未见明显相关性。

关键词：鲍曼不动杆菌；耐药性；脉冲场凝胶电泳；分子分型；体外黏附能力

Study on the drug resistance and in vitro adhesion ability difference ofAcinetobacterbaumanniiwith different genotypesTALa1，WANGJunrui2，CUIJinghua3，DUXiaoli3，YANGLimin4，SUNPeng4，WEIChangmei1，ZHANGJunli2

.(1.InnerMongoliaMedicalUniversity,InnerMongoliaHohhot010110,China; 2.DepartmentofClinicalLaboratory,theAffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity,InnerMongoliaHohhot010050,China； 3.NationalInstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China; 4.PathogenicMicrobeResearchCenter,InnerMongoliaMedicalUniversity,InnerMongoliaHohhot010059,China)

Abstract:ObjectiveTo analyze the drug resistance characteristics and in vitro adhesion abilities of Acinetobacter baumannii with different genotypes， to provide the reference for further study on the relationship between the evolution of drug resistance of Acinetobacter baumannii and its adhesion ability change， and to guide infection prevention and control. MethodsPulsed field gel electrophoresis(PFGE) was used to do molecular typing for 50 isolates of Acinetobacter baumannii from different inpatients in Inner Mongolia. In vitro adhesion abilities of Acinetobacter baumannii with different genotypes were detected by fibronectin adherence assay. ResultsThe 50 isolates had 22 PFGE genotypes， among which A and E types were the advantageous types, and the rates were 22%(11/50)and 24%(12/50)， while the isolates with L type were resistant to all tested antibiotics, and the drug resistance of the isolates belonging to the remaining genotypes were significantly different. The isolates of A type were mainly isolated from 2 regions, Xing′an Meng and Chifeng City. The isolates of E type were all isolated from Hohhot. Fibronectin adherence assay showed that the isolates with G type and J type showed the highest in vitro adhesion ability， while the isolates with J type were sensitive to all tested antibiotics, and the isolates with D type showed the lowest in vitro adhesion ability, only being resistant to carbapenem. ConclusionsThe genotypes of Acinetobacter baumannii isolated from Inner Mongolia show diverse features， which seems to be specific with different districts. There is no significant correlation between the drug resistance acceleration of Acinetobacter baumannii and its in vitro adhesion abilities.

Key words:Acinetobacter baumannii; Drug resistance; Pulsed field gel electrophoresis; Molecular typing; In vitro adhesion ability

鲍曼不动杆菌是一种非发酵糖、氧化酶阴性、无动力的革兰阴性杆菌，广泛分布于自然界、医院环境等，是引起医院感染的一种重要的条件致病菌。近年，我国住院患者中鲍曼不动杆菌的分离率和耐药率均呈逐年上升趋势，对碳青霉烯类抗菌药物的耐药率达57%以上[1]。新德里金属β-内酰胺酶(New Delhi metallo-beta lactamase 1, NDM-1)超级耐药细菌的出现[2]，使各国医疗机构对鲍曼不动杆菌耐药性及其致医院感染的重视程度进一步增强。但耐药性不断增加的同时，鲍曼不动杆菌致病力是否相应增加尚不明确。鲍曼不动杆菌致病力的强弱不仅与宿主易感性相关，还与其侵袭力密切相关。作为鲍曼不动杆菌侵袭宿主的第一步，黏附能力的强弱决定其后续的生物膜形成、侵入宿主细胞等致病过程[3]。但针对不同鲍曼不动杆菌体外黏附等致病特征与其耐药性之间的相关性研究报道甚少。因此，本研究拟以内蒙古不同地区住院患者分离的鲍曼不动杆菌为研究对象，采用脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis， PFGE)进行分子分型，分析不同地区分离株基因型及耐药特征是否呈现特征性分布；同步采用体外黏附试验检测不同基因型鲍曼不动杆菌体外黏附能力的变化，分析不同耐药表型分离株体外黏附能力是否存在差异，为更好地防控和治疗多重耐药鲍曼不动杆菌医院内感染提供新的试验数据和思路。

材料和方法

一、菌株来源

收集2011年11月至2013年10月从临床标本中分离的鲍曼不动杆菌50株，其中来自分泌物24株、痰液9株、脓液8株、尿液4株、血液3株、肺泡灌洗液1株、咽拭子1株。地区分布为内蒙古中部呼和浩特市22株，东部赤峰市9株，东北部呼伦贝尔市11株、兴安盟8株。所有入选菌株均经VITEK-2 Compact 全自动微生物鉴定系统进行重新鉴定。

二、主要试剂

PFGE使用胶为SeaKem@Gold Agarose低熔点琼脂糖胶(Bio-Rad公司，美国)；细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；革兰阴性菌鉴定卡(GN Card)及革兰阴性细菌药物敏感性卡片(AST-GN16 Card)购自法国生物梅里埃公司。

三、主要仪器

VITEK-2 Compact全自动微生物鉴定系统为法国生物梅里埃公司产品。PFGE仪为美国伯乐Bio-rad CHEF DRⅢ，凝胶成像系统为美国伯乐Bio-rad Gel Doc XR，PFGE图谱分析软件采用BioNumerics V 5.1版本。

四、方法

1. 细菌鉴定及药物敏感性试验将收集的菌株接种于麦康凯平板上，37℃培养18～24 h，采用VITEK-2全自动微生物鉴定系统进行再次鉴定。抗菌药物均采用革兰阴性菌药物敏感性卡片(VITEK-2 AST-GN16卡)进行检测。药物敏感性试验结果参照美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)2013版本M100-S23文件进行判定，质控菌株为大肠埃希菌(ATCC 25922)。

2. PFGE分型菌株复活后， 挑取新鲜单个菌落接种至LB培养基中，37℃孵育18～24 h，刮取适量细菌，悬浊于细胞菌悬液中。调整细胞悬液浓度，用比浊仪(bioMerieux Vitek colorimeter)测其浓度至4.0～4.5麦氏单位。取400 μL菌悬液和20 μL蛋白酶K(储存液浓度为20 mg/mL)37℃水浴中孵育后与等体积的1%Seakem Gold混合制胶。用细胞裂解液和蛋白酶K进行细菌的裂解，再用水和三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸缓冲液冲洗胶块。切胶，酶切(ApaⅠ，TAKARA)，37℃水浴4 h。电泳参数为138 mA，脉冲时间为5～40 s，电泳时间18 h。电泳结束后用GelRed染剂染色，然后进行凝胶成像系统观察并拍照。

3. 纤维黏连蛋白黏附试验试验前1天用人纤维黏连蛋白10 μg/mL包被96孔细胞培养板，4℃过夜孵育，经磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)(牛血清白蛋白1%)洗涤2次，再取牛血清白蛋白溶液125 μL 37℃封闭1 h，经PBS洗涤3次。将待检鲍曼不动杆菌常规接种于羊血琼脂培养基，37℃孵育过夜，重悬于PBS中，调整浓度至1麦氏单位。取62.5 μL菌悬液和等量PBS混合，加入包被的96孔细胞培养板中，37℃孵育2 h，经PBS洗涤4次去除未黏附细菌，之后加入0.5% Triton X-100，室温30 min，取1 μL接种麦康凯培养基，37℃孵育24～48 h，人工计数细菌菌落，以细菌菌落数的多少反映每株鲍曼不动杆菌黏附能力的强弱。

结果

一、体外药物敏感性试验

50株鲍曼不动杆菌体外药物敏感性试验结果见表1。

二、PFGE分型

PFGE后，经ApaⅠ酶切，按照相似度90%分为22种基因型和29种亚型：A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、P、Q、R、S、T、U、V。A和E型为优势带型，分别占22%(11/50)和24%(12/50)；L型对所有受试的抗菌药物均耐药，其余基因型耐药表型差异明显，见图1。优势型A型菌株共11株，主要分布在东北部地区兴安盟和赤峰市(81.82%，9/11)；优势型E型菌株共12株，则主要分布在中部地区呼和浩特市(11/12)。

表1　50株鲍曼不动杆菌药物敏感性试验结果

注：MIC为最低抑菌浓度

图1　50株鲍曼不动杆菌PFGE分型

根据PFGE分型，优势基因型A型对一代和二代头孢类抗菌药物、阿莫西林-克拉维酸、环丙沙星、呋喃妥因、氨苄西林和氨基糖苷类抗菌药物的耐药率最高，为100%；对亚胺培南和哌拉西林-他唑巴坦的耐药率最低，为0%；对复方磺胺甲噁唑、左氧氟沙星和替加环素的耐药率分别为91%、45%和27%。优势基因型E型对阿莫西林-克拉维酸、环丙沙星、氨苄西林和氨曲南的耐药率最高，为100%；对替加环素的耐药率最低，为33%；对头孢唑啉、头孢西丁、庆大霉素、左氧氟沙星、哌拉西林-他唑巴坦、头孢曲松、呋喃妥因、亚胺培南、复方磺胺甲噁唑、妥布霉素和头孢吡肟的耐药率在两者之间，但均在50%以上。见图2。

注：R表示耐药；I表示中介；S表示敏感

图22种主要基因型鲍曼不动杆菌耐药特征

三、体外黏附试验

黏附试验结果显示，体外黏附能力最强的菌株归属于PFGE G型(A19)和J型(A30)，前者仅对头孢菌素类和阿莫西林-克拉维酸耐药，后者对所有受试抗菌药物均敏感；黏附能力最弱的菌株为PFGE D型(A41)，仅对亚胺培南敏感。见图3。

图3　黏附试验人工计数细菌菌落数

讨论

鲍曼不动杆菌是目前我国住院患者中分离率最高的病原菌之一，且其耐药性呈不断增长趋势。从我国CHINET耐药监测数据来看，各地分离的鲍曼不动杆菌对除米诺环素和头孢哌酮-舒巴坦外的大多数抗菌药物的耐药率均在50%以上，特别是对碳青霉烯类药物。鲍曼不动杆菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率从2007年的37.6%和42.7%分别上升至2012年的57%和61%[4-5]。究其原因，鲍曼不动杆菌可以通过多种途径对抗菌药物产生耐药[6]。因此，近年针对鲍曼不动杆菌的研究大多集中在其耐药机制方面[7-8]，但对鲍曼不动杆菌致病力及致病机制的研究相对较少。

有研究显示，在鲍曼不动杆菌发挥致病力的初始阶段，首先通过其外膜蛋白ompA介导细菌与纤维黏连蛋白结合，实现与细胞外基质和宿主细胞之间的黏附，为细菌进一步在组织局部定植、生长繁殖、生物被膜形成及侵入宿主细胞创造条件[9-10]。黏附的鲍曼不动杆菌通过分泌多糖蛋白复合物将自身克隆集聚包裹于其中而形成生物被膜，而被膜的屏蔽作用使细菌接触到的抗菌药物浓度和速度明显降低，从而进一步介导细菌耐药性的产生。因此，生物被膜形成被认为是鲍曼不动杆菌的主要致病机制之一，也是当前研究的一个热点[11-12]。王国戗等[13]发现细菌一旦形成生物被膜，在体内耐药性将大幅增加，是形成慢性持续性细菌感染的重要原因。另有研究发现，眼部分离的鲍曼不动杆菌具有明显的体外黏附、侵入宿主细胞及生物膜形成能力[14]。提示不同来源部位菌株黏附能力等致病特征可能存在差异。纤维黏连蛋白黏附试验是用于评估细菌体外黏附能力的常用方法，目前已在金黄色葡萄球菌等常见病原菌体外黏附特征的研究中广泛应用。本研究所用方法在相关研究的基础上进行了改良，试验可重复性更好。本研究采用纤维黏连蛋白黏附试验进一步分析不同来源及具有不同耐药特征的鲍曼不动杆菌体外黏附能力是否存在差异，结果发现，黏附能力最强的2株菌株分离部位全部来自脓液，而最弱的株则来自尿液，黏附能力的强弱是否与分离部位有关，还需进一步试验来明确。本研究同时发现，优势基因型鲍曼不动杆菌的耐药性高于非优势型菌株，但其体外黏附能力未见相应增加。鲍曼不动杆菌耐药性的增加与其体外黏附能力并未见明显相关性。目前针对不同耐药特征的鲍曼不动杆菌，体外耐药性的变化与其致病力之间的相关性研究报道甚少。但由于本研究所选菌株例数有限，为进一步证实鲍曼不动杆菌耐药性演变与其致病力变化之间的相关性，更加深入的多中心、大样本研究有待进一步开展。

本研究PFGE分子分型结果发现内蒙古地区分离的鲍曼不动杆菌基因型呈现多样性，特定基因型菌株具有相同或相近的耐药特征，且呈现一定的地区分布特点。如A型优势株中编号为16、18、24、25、38、40、43、45的菌株具有相同的耐药特征，且均分布在内蒙古东北地区；E型优势株中编号为1、4、5、7、12、13、47的菌株耐药特征相同，分布在呼和浩特地区。A型中的2种亚型AⅠ和AⅡ在PFGE结果中显示仅有1条条带的不同，反映到耐药特征上也稍有差异。如A45和A36对替加环素的MIC值分别为4和2 μg/mL。对PFGE优势型A型和E型的菌株随机选择3～4株进行多位点序列分型[15]，结果显示A型和E型分别归属于ST92和ST208型。ST92和ST208均属于欧洲克隆Ⅱ和克隆复合体92(CC92)，而CC92是世界范围内流行最广泛的克隆复合体[16]。有研究显示，欧洲克隆Ⅱ型菌株的黏附能力强于Ⅰ型，且生物被膜形成能力要高于Ⅰ型，基因组的重排、代谢能力以及环境因素的影响，可能造成不同克隆株之间的致病潜力出现差异[17]。不同地区分离流行株的生物学特性尚需进一步研究，特别对于耐药性和毒力特征的演变，以便更好地指导特定地区分离株的感染防控和治疗。

综上所述，内蒙古地区鲍曼不动杆菌临床分离株基因型呈多样化，不同基因型菌株耐药谱差异明显。本研究结果初步揭示了不同基因型鲍曼不动杆菌体外黏附能力存在明显的差异，可能与菌株分离部位存在一定相关性。但菌株耐药性的增加与其体外黏附能力的特征并未见明显相关性。由于本研究所选菌株有限，关于鲍曼不动杆菌耐药性变化与其致病力之间的相关性尚需进一步研究，以便为临床上更好防控及治疗多重耐药及泛耐药鲍曼不动杆菌感染提供理论依据，降低耐药菌株的传播。

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(本文编辑：姜敏)

2015年《检验医学》举办“检验医学新技术”国家级继续教育项目的通知

为满足全国检验医学工作者对继续教育的需求，充实基础理论知识、促进检验医学水平、提高教学和科研质量，节省有关检验医学工作者接受继续教育的费用和时间，在期刊编委专家们的积极支持下，经国家继续教育委员会批准，《检验医学》将于2015年度举办“检验医学新技术”[Ⅰ类10分，项目编号：2015-11-00-281 (国)，由上海市临床检验中心主办]国家级继续教育项目。具体实施方案如下：

1. 学员对象具有中级或中级以上专业技术职称、正在从事医学检验或其他相关专业技术工作的卫生技术人员均可参加。

2. 继续教育内容临床检验与血液学检验、免疫学检验、微生物学检验、生物化学检验、分子生物学检验、实验室管理等检验医学领域的新技术、新进展，均出自期刊发表的文章。

3. 学员报名步骤欲参加继续教育项目者，请将回执(见第488页)复印、填写后寄回(回执请务必填写完整，信封上注明“参加继续教育”)；也可以登录期刊网站(http://www.shjyyx.com)，在“编辑部公告”中下载、填写回执，并将回执用E-mail(该E-mail地址请与回执中填写的一致)发回；或登录上海市临床检验中心网站(www.sccl.org.cn)直接报名参加。编辑部以收到学员报名的回执和教育费用的次序作登记注册和编号。

4. 考试方法编辑部将试卷寄给注册过的学员(试卷复印无效)，考试合格者参照国家《继续教育学分授予方法》授予继续教育学分证书。编辑部将依据学员报名登记、注册编号、交费记录和考试成绩寄发学分证书。

5. 时间安排2015年4月1日至10月30日。

6. 收费标准300元。

读者如有疑问，请咨询期刊编辑部。

地址：上海市浦东新区洪山路528号《检验医学》编辑部邮编：200126

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电话：021-68316211；传真：021-68315766E-mail：shyy_jm@126.com

上海市临床检验中心《检验医学》编辑部

2015年4月

收稿日期：(2014-07-09)

中图分类号：

文章编号：1673-8640(2015)05-0468-06R446.5

文献标志码：ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.05.015

通讯作者：张军力，联系电话：0471-6637610。

作者简介：塔拉，女，1988年生，学士，主要从事临床检验诊断学研究。