华东医院感染老年患者多重耐药和广泛耐药革兰阴性杆菌的耐药性分析

方　毅，　赵付菊，　赵　虎

华东医院感染老年患者多重耐药和广泛耐药革兰阴性杆菌的耐药性分析

方毅，赵付菊，赵虎

(复旦大学附属华东医院检验科，上海 200040)

摘要：目的了解华东医院感染老年患者多重耐药和广泛耐药革兰阴性杆菌耐药性及其分布，为指导临床合理使用抗菌药物和有效预防、控制医院感染提供依据。方法收集华东医院60岁以上老年患者临床标本(痰液、血液、尿液、胆汁及伤口分泌物等)进行细菌培养、鉴定和体外药物敏感性试验；对228例多重耐药和42例广泛耐药革兰阴性杆菌感染的患者资料进行回顾性研究，并用聚合酶链反应(PCR)检测8株广泛耐药的鲍曼不动杆菌的相关耐药基因。结果多重耐药菌排名前3位的是鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希菌；广泛耐药菌排名前3位的是鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和洋葱伯克霍德菌。广泛耐药的鲍曼不动杆菌检测到了TEM、SHV、PER、ant(2″)-Ⅰ、ant(3″)-Ⅰ、ant(6′)-Ⅰb、OXA-23、gyrA和qacEΔ1基因，IMP、VIM和OXA-24基因检测为阴性。结论华东医院老年患者医院感染的鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌耐药情况较为严重，呼吸科和重症监护病房尤其要加强抗菌药物的合理使用并进行细菌耐药性的监测等措施，有效预防、延缓和控制耐药菌株的产生和播散。

关键词：耐药基因；多重耐药菌；广泛耐药菌；革兰阴性杆菌；医院感染；老年

Analysis of drug resistance of multi-drug resistant and extensively-drug resistant Gram negative bacillus from the elder patients with nosocomial infection in Huadong HospitalFANGYi，ZHAOFuju，ZHAOHu

.(DepartmentofClinicalLaboratory，HuadongHospital，FudanUniversity，Shanghai200040，China)

Abstract:Objective To guide the reasonable antibiotic clinical use and provide the reference for effective prevention and nosocomial infection control by understanding the drug resistance and distribution in elder patients infected with multi-drug resistant and extensively-drug resistant Gram negative bacillus in Huadong Hospital. MethodsThe data of 228 elder patients infected with multi-drug resistant bacillus and 42 patients infected with extensively-drug resistant bacillus were studied retrospectively(all the elder patients were over 60 years old). Bacterial culture， identification and drug susceptibility were performed for the specimens from patients(sputum， blood， urine， bile， wounds secretion and so on). The resistant genes of 8 extensively-drug resistant Acinetobacter baumannii were determined by polymerase chain reaction(PCR). ResultsThe rank of the multi-drug resistant bacillus was Acinetobacter baumannii， Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli， as well as the rank of the extensively-drug resistant bacillus was Acinetobacter baumannii， Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. The TEM， SHV， PER， ant(2″)-Ⅰ， ant(3″)-Ⅰ， ant(6′)-Ⅰb， OXA-23， gyrA and qacEΔ1 genes were detected in the extensively-drug resistant Acinetobacter baumannii. The results of IMP, VIM and OXA-24 genes were negative. ConclusionsSince the severe drug resistance of Acinetobacter baumannii and Pseudomonas aeruginosa from elder patients in Huadong Hospital， especially in the department of respiration and intensive care unit， we should effectively prevent， delay and control the generation and spreading of resistant isolates by strengthening the reasonable antibiotic use as well as monitoring the resistant isolates.

Key words:Drug resistant gene; Multi-drug resistant bacterium； Extensively-drug resistant bacterium； Gram negative bacillus； Nosocomial infection； Elder

近年来，随着抗菌药物的广泛使用，多重耐药菌感染率呈全球性上升趋势，尤其是广泛耐药菌株的出现使抗感染治疗面临无药可用的境地，感染性疾病的预防和控制愈加困难[1]。不同时期、不同地区及不同医院间细菌耐药性存在明显差异[2]，因此细菌耐药监测对抗菌药物的合理使用及有效感染控制措施的实施尤为重要。为了解华东医院老年患者医院感染的多重耐药和广泛耐药菌株的分布及耐药特点，我们检测并分析了华东医院2010年9月至2012年9月228株多重耐药菌和42株广泛耐药菌株。

材料和方法

一、 菌株来源

收集华东医院2010年9月至2012年9月检验科细菌室从各病区医院感染[3]的老年患者(年龄>60岁)痰液、血液、尿液、胆汁及伤口分泌物等标本中分离的多重耐药菌株228例和广泛耐药菌株42例，剔除同一患者同一部位重复分离的菌株。质控菌株：铜绿假单胞菌(ATCC 27853)、大肠埃希菌(ATCC 25922)、大肠埃希菌(ATCC 35218)，由上海市临床检验中心提供。

二、 主要仪器和试剂

VITEK(JR型)全自动微生物分析系统及其配套的鉴定卡和药物敏感性分析卡(法国生物梅里埃公司)。中国兰琼脂平板、血琼脂平板、巧克力琼脂平板、双糖铁琼脂(科玛嘉公司)，含树脂需氧血培养瓶(BD公司)，中和抗菌药物需氧血培养瓶(法国生物梅里埃公司)。实验用的板条包括阴性杆菌鉴定卡(GNI+)和阴性杆菌药物敏感性卡(GNS-448)。GNS-448包括阿米卡星、氨苄西林、头孢唑啉、头孢肶肟、头孢哌酮-舒巴坦、头孢噻肟、头孢西丁、头孢他啶、头孢呋辛、庆大霉素、亚胺培南、左氧氟沙星、美罗培南和哌拉西林-他唑巴坦。

三、菌株的鉴定与药物敏感性分析

用VITEK全自动细菌分析仪进行细菌的鉴定和体外药物敏感性试验，按操作指南进行。根据美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute， CLSI)的抗微生物药物敏感性试验操作方法和判断标准对药物敏感性试验的结果进行评价[4]。

四、广泛耐药鲍曼不动杆菌的耐药基因检测

1.细菌DNA提取按照北京天根生化科技有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒操作说明进行细菌DNA提取。

2.引物设计参考有关文献[5]，基因对应的引物序列见表1，引物合成由上海桑尼生物科技有限公司完成。

表1　各基因对应的引物序列

3. 基因检测按照试剂盒操作进行扩增，不同引物设立不同的聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)条件，用1%的琼脂糖凝胶100 V电泳50 min，经凝胶成像仪观察结果。

五、统计学方法

采用WHONET 5.6软件进行数据分析。

结果

一、 耐药菌株的细菌构成比

228株多重耐药的革兰阴性杆菌中，鲍曼不动杆菌占34.2%(78/228)、铜绿假单胞菌占31.6%(72/228)、大肠埃希菌占14.0%(32/228)、嗜麦芽窄食单胞菌占7.0%(16/228)、肺炎克雷伯菌占3.1(7/228)、洋葱伯克霍德菌占2.6%(6/228)、其他菌株占7.5%(17/228)。42株广泛耐药菌株中，鲍曼不动杆菌占71.43%(30/42)、铜绿假单胞菌占23.81%(10/42)、洋葱伯克霍德菌和嗜麦芽窄食单胞菌均占2.38%(1/42)。

二、菌株标本来源及科室分布

多重耐药菌株主要分离自痰液，占72.37%(165/228)；其次为尿液，占15.79%(36/228)；而后是血液，占3.07%(7/228)；主要分布在呼吸科病房[25.44%(58/228)]、综合病房[27.20%(62/228)]及重症监护病房[17.11%(39/228)]。广泛耐药菌株主要分离自痰液，占90.48%(38/42)；其次为尿液，占4.76%(2/42)，血液和引流液均占2.38%(1/42)；主要分布在呼吸科病房[50.00%(21/42)]、重症监护病房[19.05%(8/42)]及综合病房[16.67%(7/42)]。

三、 8株广泛耐药鲍曼不动杆菌耐药基因检测

β-内酰胺酶基因中，8株广泛耐药鲍曼不动杆菌有5株TEM基因和SHV基因检测阳性，有6株携带OXA-23基因，还有3株携带PER基因，均未发现IMP、VIM和OXA-24基因。氨基糖苷类修饰酶基因中，8株ant(6′)-Ⅰb基因均阳性，6株ant(3″)-Ⅰ基因阳性，4株携带ant(2″)-Ⅰ基因。喹诺酮类基因中，8株gyrA基因均阳性。外排泵基因中，8株qacEΔ1基因均阳性。见表2。

表2　8株广泛耐药鲍曼不动杆菌耐药基因检测结果

讨论

细菌耐药已经成为全球最严重的公共卫生问题，多重耐药甚至广泛耐药菌株的不断出现不仅增加了临床抗感染治疗的难度，也增加了患者的医疗费用，加重了社会和家庭的经济负担[6-7]。多重耐药菌是对3种或3种以上的抗菌药物(如头孢类、氨基糖苷类和碳青霉烯类等)耐药的细菌[8]；泛耐药菌是指对包括多黏菌素和替加环素在内所有测试的抗菌药物全部耐药的细菌[9]；广泛耐药菌是对除多黏菌素和替加环素以外测试的抗菌药物全部耐药的细菌[10]。本研究主要是针对华东医院广泛耐药菌感染患者进行的耐药性分析。

华东医院为上海市老年医学中心，以老年医学为特色，老年患者居多。老年患者原发性疾病多，住院时间长，机体抵抗力差，易患医院感染，而且医院感染的病原菌种类与普通综合性医院有所差异，如2012年上海地区的耐药性监测网显示，由广泛耐药菌引起的医院感染，综合性三级甲等医院的病原菌主要是鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌，而华东医院主要是鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌，广泛耐药的肺炎克雷伯菌目前还不多见[11]。故本研究重点分析华东医院老年患者医院感染多重耐药和广泛耐药菌的特征，为老年患者医院感染的预防和治疗提供参考依据。

华东医院老年患者医院感染位于前3位的多重耐药菌是鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希菌，与陈萍等[12]报道的住院患者感染多重耐药菌依次为大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌有所不同，其原因可能与华东医院主要以老年人群为主有关，患者基础疾病较多，免疫力低下，住院时间较长，使用侵入性治疗手段较多。排名前2位的广泛耐药菌是鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌，与上海地区及全国的耐药监测结果一致[13-14]。多重耐药和广泛耐药的菌株主要来自痰液、尿液和血液，和文献报道相仿[15]，提示耐药菌株主要引起呼吸系统感染性疾病，结合菌株主要分布在呼吸科、重症监护病房及综合病房，建议临床治疗这3个病区医院感染患者应慎重选择抗菌药物，相应病区的医护人员应加强环境设备的清洁和消毒，适时采取隔离，尤其是广泛耐药菌株所在病区更应引起高度重视，尽量专人护理，仪器专人专用，预防和控制耐药菌株的传播和流行。

鲍曼不动杆菌是医院感染中最常见的病原菌之一，获得耐药性和克隆传播的能力强，被视为我国最重要的“超级细菌”[15]，它可引起多种医院感染，包括呼吸道感染、败血症、脑膜炎、尿路感染和腹腔感染等。本研究对8株广泛耐药鲍曼不动杆菌的耐药基因进行检测分析，发现这8株菌均携带了氨基糖苷类修饰酶基因ant(6′)-Ⅰb、喹诺酮类基因gyrA和外排泵基因qacEΔ1。β-内酰胺酶基因中，分别检测到了TEM、SHV、OXA-23和PER基因，未检测到IMP、VIM和OXA-24基因，可能与被检菌株较少有关。

本研究结果表明，华东医院老年患者感染耐药菌株的发生率高，且耐药菌株可在患者体内定植，更易引起耐药菌株的传播和流行，因此华东医院的医院感染控制科、细菌室及其相关临床科室应该互相配合，采取相应的措施，包括对多重耐药菌和广泛耐药菌的感染进行监测，对于已经感染此两类菌的患者进行隔离并加强所在病区的环境清洁和消毒，防止感染范围的扩大；严格手卫生，防止交叉感染；严格遵守无菌操作和感染控制规范，合理使用抗菌药物，最大程度地避免此两类菌引起的医院感染的暴发和流行，减少危重患者的死亡率，预防和控制严重感染和反复感染的发生。

参考文献

[1]FALAGAS ME， RAFAILIDIS PI， MATTHAIOU DK， et al. Pandrug-resistantKlebsiellapneumoniae，PseudomonasaeruginosaandAcinetobacterbaumanniiinfections: characteristics and outcome in a series of 28 patients[J].Int J Antimicrob Agents，2008，32(5):450-454.

[2]晏群，李军，李虹玲，等.2011年湘雅医院临床分离病原菌分布及耐药性分析[J].中国病原生物学杂志，2012，25(7):539-543.

[3]中华人民共和国卫生部. 医院感染诊断标准(试行)[J].中华医学杂志，2001，81(5):314-320.

[4]Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; twenty-second informational supplement[S]. M100-S22， CLSI， 2012.

[5]马全玲，李婉琛，曹阳，等.泛耐药鲍曼不动杆菌相关耐药基因检测及亲缘性分析[J].国际流行病学传染病学杂志，2012，39(6):373-377.

[6]KANG CI， SONG JH. Antimicrobial resistance in Asia: current epidemiology and clinical implications[J]. Infect Chemother, 2013，45(1):22-31.

[7]张冀霞，王占伟，王启，等.替加环素对临床常见多重耐药菌的体外抗菌活性研究[J].中华检验医学杂志，2013，36(4):308-312.

[8]WATTAL C， GOEL N， OBEROI JK， et al. Surveillance of multidrug resistant organisms in tertiary care hospital in Delhi， India[J]. J Assoc Physicians India， 2010， 58(Suppl): 32-36.

[9]李春辉. MDR、XDR、PDR多重耐药菌暂行标准定义——国际专家建议[J]. 中国感染控制杂志，2014，13(1):62-64..

[10]陈中举，孙自镛，胡志东，等.2012年中国CHINET肠杆菌属细菌耐药性监测[J]. 中国感染与化疗杂志，2014，14(5)：387-391.

[11]朱德妹，汪复，郭燕，等.2012年上海地区细菌耐药性监测[J]. 中国感染与化疗杂志，2013，13(6)：409-419.

[12]陈萍，刘丁，方清永，等.住院患者多重耐药菌感染临床研究[J].中国微生态学杂志，2013，25(8):962-965.

[13]朱德妹，张婴元，汪复，等.2010年上海地区细菌耐药性监测[J].中国感染与化疗杂志2011，11(6):436-445.

[14]朱德妹，汪复，胡付品，等.2010年中国CHINET细菌耐药性监测[J].中国感染与化疗杂志，2011，11(5):321-329.

[15]陶勇，徐俊炜，陆俊国.2010～2011年度我院多重耐药细菌的分布及耐药性分析[J].齐齐哈尔医学院学报，2012，33(21):2956-2959.

[16]陈佰义，何礼贤，胡必杰，等.中国鲍曼不动杆菌感染诊治与防控专家共识[J].中国医药科学，2012，2(8):3-8.

(本文编辑：姜敏)

注： 周悦昌与任丽娜对本研究具有同等贡献，并列为第一作者。

收稿日期：(2014-06-16)

中图分类号：

文章编号：1673-8640(2015)05-0474-04R446.5

文献标志码：ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.05.016

通讯作者：赵虎，联系电话：021-62483180-20847。

作者简介：方毅，男，1973年生，学士，副主任技师，主要从事临床微生物检验工作。

基金项目：华东医院院级课题资助项目(H-646)