单一位点夹心抗体法结合循环增强荧光免疫技术检测BNP的评估

肖春海，　梁　爽，　刘静凡，　李飞飞，　朱庆华，　瞿培培，　董志武

单一位点夹心抗体法结合循环增强荧光免疫技术检测BNP的评估

肖春海，梁爽，刘静凡，李飞飞，朱庆华，瞿培培，董志武

(上海市第六人民医院金山分院检验科，上海 201500)

摘要：目的初步评价单一位点夹心抗体(SES)法结合循环增强荧光免疫技术(CEIFA)检测B型钠尿肽(BNP)的性能。方法用SES法结合CEIFA仪检测BNP，对其精密度、线性范围、功能敏感性、回收率、样本稳定性及与西门子ADVIA Centaur CP化学发光仪(简称Centaur CP)的相关性进行评估。结果SES法结合CEIFA的批内和批间变异系数(CV)分别为4.38%～7.84%和10.47%～11.21%。线性范围为25～5 000 pg/mL。功能敏感性为12.5 pg/mL。回收率为95.04%～109.2%。与Centaur CP比较，其回归方程为Y=0.998 3X-22.38(r=0.969，P<0.01)。对样本稳定性的要求低于Centaur CP。结论SES法结合CEIFA测定BNP具有较好的性能，与传统的双抗体夹心发光法比较有一定优势，适合临床急诊实验室使用。

关键词：B型钠尿肽；单一位点夹心抗体；荧光免疫分析；心力衰竭

Evaluation of BNP quantification by single-epitope sandwich combined with cyclic enhanced immunofluorescent assayXIAOChunhai，LIANGShuang，LIUJingfan，LIFeifei，ZHUQinghua，QUPeipei，DONGZhiwu

.(DepartmentofClinicalLaboratory，JinshanBranchofShanghaiSixthPeople′sHospital，Shanghai201500，China)

Abstract:ObjectiveTo evaluate B-type natriuretic peptide quantification by single-epitope sandwich(SES)combined with cyclic enhanced immunofluorescent assay(CEIFA). MethodsBy SES combined with CEIFA, BNP was determined. The precision, linear range, function sensitivity, recovery rate and sample stability were evaluated, and 45 samples were determined by the method, which the results were evaluated with those of SIEMENS ADVIA Centaur CP chemiluminescence analyzer (Centaur CP). ResultsThe within-run and between-run coefficients of variation(CV) were 4.38%-7.84% and 10.47%-11.21%, respectively. The linear range was 25-5 000 pg/mL. The function sensitivity was 12.5 pg/mL. The recovery rate was 95.04%-109.2%. The correlation formula between the novel method and Centaur CP was Y=0.998 3X-22.38 (r=0.969, P<0.01). The request of sample stability of SES combined with CEIFA was lower than that of Centaur CP. ConclusionsSES combined with CEIFA for BNP quantification has a good performance, and there are some advantages compared with traditional double-antibody sandwich chemiluminescence assay.

Key words:B-type natriuretic peptide; Single-epitope sandwich; Immunofluorescent assay; Heart failure

B型钠尿肽(B-type natriuretic peptide，BNP)属于利钠肽家族，由日本学者首先从猪脑中分离出来，但却主要由心室肌细胞分泌，与左心室承受的压力大小密切相关，所以现在更多称“B型利钠肽”。人类BNP基因位于1号染色体端臂远端，包括2个内含子和3个外显子。BNP前体(BNP precursor, proBNP)裂解后同时产生具有环状结构的BNP和氨基末端碎片(N-terminal proBNP，NT-proBNP)，两者都可作为心力衰竭诊断的有效特异指标[1-3]。BNP虽然在诊断呼吸困难、肺栓塞、肺癌等疾病的过程中发挥重要作用[4-6]，但目前应用较多的仍为心血管领域[1-3，7-10]。我们主要是利用循环增强荧光免疫技术(cyclic enhanced immunofluorescent assay, CEIFA)结合单一位点夹心抗体(single-epitope sandwich，SES)法[11]实现BNP的检测。

材料和方法

一、材料

1. 研究对象45份上海市第六人民医院金山分院心内科患者的乙二胺四乙酸二钾盐新鲜抗凝血浆；星童公司BNP标准品，浓度为100、1 000和5 000 pg/mL。

2.试剂与仪器西门子ADVIA Centaur CP化学发光仪(简称Centaur CP)及其配套BNP试剂盒(批号35890171)，星童Pylon Core荧光免疫分析仪(简称Pylon Core) 及其配套BNP试剂盒(批号000502191411)和BNP稀释液(批号000502181529)。

二、原理

1. CEIFA原理将气化的3-氨基丙基硅烷均匀镀在石英针表面，在疏水作用下可以将单克隆抗体固化在石英针的表面，形成捕捉抗体。通过二甲基甲酰胺分别将生物素与另一单克隆抗体偶联形成生物素化抗体，将荧光素(花青染料5)与多聚糖-链霉亲和素偶联成荧光素-多聚糖-链霉亲和素复合物。CEIFA利用生物素化的捕捉抗体对待测抗原的特异性以及对链霉亲和素荧光偶联物质的特异性，通过循环反应实现荧光信号的循环放大。见图1。

2. SES原理SES由HyTest公司发明，利用BNP环抗体能特异结合BNP的环状结构的11～16位氨基酸，形成新的抗原抗体复合物，同时此复合物能作为抗原，形成新的抗原特异位点，与此复合物的抗体特异性结合，从而实现针对一个单克隆抗原位点的特异性夹心反应。见图2。

3. CEIFA与SES法结合检测BNP的过程固化后的BNP单克隆抗体作为捕捉抗体与样本中完整的BNP分子和部分降解的BNP分子进行结合，清洗后与另一生物素化BNP单克隆抗体进行双抗体夹心反应，清洗后再与荧光素-多聚糖-链霉亲和素反应，之后再分别与生物素化BNP单克隆抗体和荧光素-多聚糖-链霉亲和素反应循环3次，实现荧光信号的放大，进行检测。见图3。

三、方法

1.精密度试验准备2个批号的BNP试剂，取BNP浓度为100 pg/mL的低值和1 000 pg/mL的高值标准品每天测3次，连续测定5 d，根据测得BNP的结果计算浓度的批内和批间的变异系数(coefficient of variation,CV)[12]。

图1CEIFA原理图

图2　SES原理图

图3　CEIFA结合SES法检测BNP的过程图

2.线性试验取5 000 pg/mL标准品进行对倍稀释，每个稀释度重复测定3次，计算平均值。将实际测定的均值与理论值进行比较，计算相关系数(r)，相对偏差应<15%。

3.功能敏感性对100 pg/mL的标准品进行对倍稀释，浓度依次为50.00、25.00、12.50和6.25 pg/mL，-80℃低温分装保存，每天测定4次，连续5 d。

4.回收试验在150 μL患者的待测血清中，分别加入BNP浓度为100和2 500 pg/mL的标准液50 μL，检测标准液加入前后样本的BNP浓度。回收率(%)=(加入标准液后BNP质量-加入标准液前BNP质量)/实际加入的BNP质量×100。

5.相关性试验45例临床样本在Centaur CP上检测的BNP值为35 ～2 435 pg/mL，同时在Pylon Core上检测，计算两者的相关性。

6.样本稳定性试验将3份急诊患者的样本同时在Centaur CP和Pylon Core上检测BNP，之后每隔2 h再分别在2台仪器上同时检测BNP，共检测5次，总时长为8 h。

四、统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行t检验、两变量相关性和回归分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、精密度试验

低值标准品(100 pg/mL)和高值标准品(1 000 pg/mL)批内和批间的BNP测定值均符合正态分布(P>0.05)，低、高值标准品批内CV分别为4.38%和7.84%，均<10%；批间CV分别为11.21%和10.47%，均<15%。

二、线性试验

将高值(5 000 pg/mL)、中值(1 000 pg/mL)和低值(100 pg/mL)的标准品进行一定倍数的稀释，然后进行检测。相对偏差均<15%，线性方程为Y=1.033X-3.348，r=0.999 8，线性范围为25 ～5 000 pg/mL。见表1。

三、功能敏感性

50.00、25.00、12.50和6.25 pg/mL 4种浓度中，12.5 pg/mL的CV为19.5%，最接近20%，所以此方法的功能敏感性为12.5 pg/mL。

四、回收试验

经检测，加入标准液前被检测样本的BNP浓度为258 pg/mL，加入标准液后样本的检测浓度分别为220.8和787.5 pg/mL。计算得平均回收率为102.12%。见表2。

五、相关性试验

45份样本在Centaur CP和Pylon Core上检测BNP的回归方程为Y=0.998 3X-22.38(r=0.969，P<0.01)。见图4。进行配对t检验，t=1.175，P>0.05。

六、样本稳定性试验

取BNP高、中、低值各3份样本，Pylon Core最初检测结果分别为1 739、421和95 pg/mL，Centaur CP分别为1 709、415和93 pg/mL。每隔2 h测定BNP。随着时间的延长，2种仪器的检测结果均逐渐降低，但Pulon Core检测值的降低速度明显没有Centaur CP快。见表3、图5。

表1　BNP线性试验结果

表2　CEIFA结合SES法检测BNP的回收试验结果

注：Y=0.998 3X-22.38;R2=0.938 9

图445份样本在Pylon Core和Centaur CP上检测BNP的回归分析

表3　样本稳定性试验结果　(pg/mL)

注：与同一样本Pylon Core均值比较， *P<0.05

时间(h)

图5样本稳定性的变化趋势

讨论

心力衰竭患者心室负荷增加时，心肌细胞分泌的proBNP由108个氨基酸组成，之后水解成为76个氨基酸的NT-proBNP和32个氨基酸的BNP[7]，所以BNP和NT-proBNP都可以作为心力衰竭的诊断指标，但目前2个指标各有优缺点。BNP半衰期短，不稳定，体内半衰期只有20 min，体外室温下2 h内测试结果可靠[11]，而NT-proBNP较BNP稳定，体外24 h内结果可靠[13]。由于NT-proBNP代谢主要通过高血流量的器官，如肝脏和肾脏等清除，而BNP主要通过钠尿肽清除受体结合经胞吞和溶酶体降解等方式进行代谢，只有少量通过肾脏清除，所以肾功能对于NT-proBNP影响很大，对BNP的影响则较小[14-15]。而心血管疾病的慢性患者多伴有不同程度的肾功能损害，NT-proBNP半衰期长，容易造成体内NT-proBNP的积累，体外检测时往往不能真实反映肾功能异常患者心肌的受损程度。BNP半衰期短，不稳定，如果BNP能及时检测，其结果对临床的可靠性会高于NT-proBNP，因为BNP更能反映患者当前心肌的受损情况。

本研究利用CEIFA实现了抗体的固化，循环反应的特点实现了信号的放大。CEIFA检测BNP具有良好的批内和批间精密度，其CV分别<10%和<15%。线性范围为25～5 000 pg/mL，功能敏感性为12.5 pg/mL，说明此方法具有敏感性高、信号放大明显等特点。本研究对此方法进行了BNP的加样回收试验和临床样本的相关性分析,结果显示CEIFA检测BNP的准确性良好(平均回收率为102.12%)，与Centaur CP的相关性较好(r=0.969,P<0.01)。

BNP分子免疫反应的特异性位点一般有3个可以选择，分别是中间的环状结构以及碳端和氮端。而传统的双抗体夹心法通常选择其中的2个位点进行反应。在样本稳定性试验过程中，随着时间的推移，Pylon Core检测BNP的结果降低程度明显没有Centaur CP快，在高值样本中尤为明显，因为此结果的产生与SES技术有着密切的关系。由于BNP分子的两端降解速度比环部快，环部相对比较稳定，Centaur CP检测BNP时其中一个单克隆抗体的结合位点为碳端的27～32氨基酸[15]，不稳定的碳端一旦水解，则不能完成双抗体夹心的反应，从而降低BNP的结合率，使检测结果降低。有报道显示BNP的体外稳定性一般在2 h之内[11,13]。如果所有样本均在2 h之内进行检测，对结果的影响不大。本研究的BNP检测结合了SES法，检测的结合位点位于相对稳定的环部(11～16氨基酸)，形成抗原抗体复合物，以此复合物作为抗原，形成新的特异性位点，再与另一特异性抗体反应，完成了单一位点的双抗体夹心反应[11,16]。由此可见，SES技术在BNP检测过程中能减缓BNP的降解对于结果的影响，能为临床提供更加准确的结果。

本研究的BNP检测法是SES法和CEIFA的结合，具有较好的检测性能，同时相对于传统的双抗体夹心法有一定的优势，所以SES法结合CEIFA检测BNP具有一定的临床推广价值，适合临床急诊实验室使用。

参考文献

[1]伍树芝. 血清NT-proBNP测定在心力衰竭患者中的应用价值[J]. 检验医学，2010，25(10): 753-755.

[2]应晓. B型钠尿肽在心力衰竭中的临床应用价值[J]. 检验医学，2010，25(4): 317-318.

[3]伍树芝，邓胜，秦伟国，等. 联合检测NT-proBNP、H-FABP和cTnI对老年重症心力衰竭患者的临床价值[J]. 检验医学，2014，29(4): 312-318

[4]杨欣，任斌辉，许林. 脑利钠肽BNP的临床应用进展[J]. 现代生物医学进展,2013,13(4):775-777.

[5]王成刚，余斐斐，方海俊，等. 氨基末端B型钠尿肽原在急诊呼吸困难患者诊治中的应用[J].检验医学，2010，25(3): 219-223.

[6]吴梅芳. B型钠尿肽对妇产科输血过程中呼吸困难的鉴别作用[J]. 检验医学，2013，28(9): 864-864.

[7]莫惠芳，吴炯，宋斌斌，等. NT-proBNP在心血管疾病高危人群中长期预后的作用[J].检验医学，2014，29(10): 1013-1018.

[8]王红练，阿祥仁. 高原地区先天性心脏病患儿血浆BNP检测的临床意义[J].检验医学，2013，28(9): 865-866.

[9]伍树芝. NT-proBNP对老年稳定型冠心病患者未来不良心脏事件风险评估价值[J]. 检验医学，2013，28(7): 567-572.

[10]刘晓峰，陈雪礼，涂艳. 血浆同型半胱氨酸与B型钠尿肽联合检测在急性心肌梗死中的应用评价[J]. 检验医学，2013，28(5): 379-381.

[11]RØSJØ H, TAMM NN, Kravdal G, et al. Diagnostic utility of a single-epitope sandwich B-type natriuretic peptide assay in stable coronary artery disease: data from the Akershus Cardiac Examination(ACE) 1 study[J]. Clin Biochem, 2012, 45(16): 1269-1275.

[12]王华梁, 吕元, 钟建明.检验医学实验室质量管理指南[M].上海:上海科学技术文献出版社， 2014:229-231.

[13]戴雯, 李艳, 苏汉文. 标本类型及存放时间对心衰患者 BNP 和 NT-proBNP检测结果的影响[J]. 微循环学杂志, 2010，20(2)：37-38.

[14]潘世扬.临床分子诊断学[M].北京:人民卫生出版社, 2013:507.

[15]TAKASE H, DOHI Y. Kidney function crucially affects B-type natriuretic peptide(BNP), N-terminal proBNP and their relationship[J]. Eur J Clin Invest, 2014, 44(3): 303-308.

[16]TAMM NN, SEMENOV AG, SEFERIAN KR, et al. Measurement of B-type natriuretic peptide by two assays utilizing antibodies with different epitope specificity[J]. Clin Biochem, 2011, 44(2-3): 257-259.

(本文编辑：姜敏)

收稿日期：(2014-12-08)

中图分类号：

文章编号：1673-8640(2015)05-0495-05R446.61

文献标志码：ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.05.020

通讯作者：董志武，联系电话：021-57331227。

作者简介：肖春海，男，1976年生，硕士，主管技师，主要从事临床生化与免疫检验研究。

基金项目：金山区科学技术创新资金资助项目(2014-3-09)