新鲜血液白细胞计数参考方法的测量不确定度评定

郭晓俊，　王　青，　宋　颖，　缪颖波，　许　蕾

新鲜血液白细胞计数参考方法的测量不确定度评定

郭晓俊，王青，宋颖，缪颖波，许蕾

(上海市临床检验中心，上海 200126)

摘要：目的探讨新鲜血液白细胞计数参考方法测量不确定度的评定方法和程序。方法用国际临床血液学标准化委员会(ICSH)推荐的参考方法对新鲜血液样本进行白细胞计数；明确整个测定过程中测量不确定度分量来源，根据国标标准化组织(ISO)《测量不确定度表述指南》(GUM)文件中有关测量不确定度的评估方法，按A、B两类不确定度的计算方式对各分量分别进行评定，计算合成标准不确定度，最后取95%可信区间，计算出扩展不确定度。结果新鲜血液白细胞计数的均值为6.71×109/L；合成标准不确定度为0.097×109/L，取95%可信区间、包含因子k=2，计算得扩展不确定度为0.19×109/L。结论新鲜血液白细胞计数参考方法的测量不确定度主要来源于重叠计数校正及加样体积。因此，对血液样本的加样稀释和测定应严加控制，确保测量结果具有较小的不确定度。同时建立了白细胞计数测量结果不确定度评估模型，可应用于白细胞计数项目的量值溯源和标准化，为常规检测系统向参考方法溯源提供有效途径。

关键词：白细胞计数；新鲜血液；参考方法；测量不确定度

Uncertainty evaluation on the reference method of leukocyte counts for fresh bloodGUOXiaojun，WANGQing，SONGYing，MAIOYingbo,XULei

.(ShanghaiCenterforClinicalLaboratory,Shanghai200126,China)

Abstract：ObjectiveTo study the evaluation method and procedure on the uncertainty of leukocyte counts by reference method for fresh blood. MethodsThe reference method recommended by the International Committee for Standardization in Hematology(ICSH) was used for leukocyte counts. The components of uncertainty were validated. The International Organization for Standardization(ISO) Guide to the Expression of Uncertainty of Measurement (GUM), type A and type B methods were used to evaluate each component. Combined standard uncertainty and expanded uncertainty were calculated according to 95% confidence interval. ResultsThe leukocyte counts from fresh blood had the average value of 6.71×109/L. The combined standard uncertainty was 0.097×109/L(95% confidence interval， coverage factor k=2), and the expanded uncertainty was 0.19×109/L. ConclusionsThe main sources of uncertainty are from the overlapped calculation correction and pipetting volume. Therefore, there should be strictly control on pipetting volume in order to make lower uncertainty. The evaluation model of uncertainty is established, which can be applied to the leukocyte counts and standardization, providing effective methods for traceability.

Key words：Leukocyte count；Fresh blood；Reference method； Uncertainty

自1993年国际标准化组织(International Standardization Organization，ISO)发布《测量不确定度表述指南》(GuidetotheExpressionofUncertaintyinMeasurement，GUM)以来，国际上表示测量结果及其不确定度在术语定义、概念、评定方法和报告的表达方式方面有了明确、统一的规定[1]。2002年4月欧洲化学测量溯源性和质量改进网络组织(European Chemical Measurement Traceability and Quality Improvement of Network Organization，EURACHEM)和分析化学国际溯源性合作小组(Chemical Analysis of International Traceability Cooperation Group，CITAC)又共同发布了《分析测量中不确定度的量化》第2版[2]。由于测量不确定度的概念在我国应用时间较短，中国合格评定国家认可委员会(China National Accreditation Service for Conformity Assessment，CNAS)建议各实验室要逐步开展测量不确定的评定及应用工作，特别是能提供校准服务的实验室必须进行不确定度的评定。我们利用相关实验研究数据和文献资料，按GUM中测量不确定度评估方法和EURACHEM/CITAC指南中不确定度的评估方式，对白细胞计数参考方法进行了测量不确定度的评定。

材料和方法

一、材料

1. 仪器Z2颗粒计数仪(美国Beckman-Coulter公司)。100、500 μL移液器(美国Drummond公司和德国Brand公司)，20 mL A级容量瓶(德国Brand公司)，主要用于血液样本的稀释。

2. 试剂ISOTON II等渗电解质溶液和溶血素以及浓度质控物(批号7497030)、乳胶标准颗粒CC Size Standard L10[批号9747287，直径9.805 μm，通过美国国家标准局(NIST)认证] 均由美国Beckman-Coulter公司提供。

3. 样本EDTA-K2抗凝新鲜健康人静脉血标本(4 h内)。去除测定时不能有溶血或有微小凝块标本。

二、被测量技术规定

2. 重叠计数校正测定原理和条件不变。测定流程：按ICSH推荐方法[3]，制备2套，每套制备4份原液白细胞稀释样本(0.02 mL+20 mL、0.04 mL+20 mL、0.06 mL+20 mL、0.08 mL+20 mL)，用溶血剂溶解红细胞，计数一定体积内的细胞数，重复检测次数分别为12、6、4、3。重叠计数通过回归分析方法进行校正[3-5]，使用回归分析方法来检查回归的线性；如分析未显示非线性，那么回归直线的交点代表最大浓度原液稀释样本(0.08+20 mL)的重叠校准值。用计数值乘以稀释倍数得出白细胞的计数值。用最小二乘法估计得到一元线性回归方程为y=bx+a。式中y为细胞计数值、x为稀释浓度、b为斜率、a为截距。

三、识别不确定度的来源

采用此测量数学模型绘制的修正因果关系图(鱼骨图)见图1。

图1　白细胞计数的因果关系图

四、量化不确定度

识别不确定度来源后，通过A类评定和B类评定方法量化这些不确定度来源所产生的不确定度分量[6，8]。

表1　重叠计数原始记录　(×109/L)

五、计算合成标准不确定度和扩展不确定度

在确定和量化了影响测量不确定度合成各分量后，计算合成标准不确定度(uc)和扩展不确定度(U)[6-7]。计算公式为

式中urel,c为合成相对标准不确定度、urel,(xi)为各不确定度分量的相对标准不确定度；k为包含因子，k=2表示正态分布95%置信概率。

表2　实测值与理论值对应关系表　(×109/L)

=0.014 51；

uc=urel,c×C=0.014 51×6.714×109

=0.097 4×109/L

U=k×uc=2×0.097 4×109=0.19×109/L。

结果

白细胞计数参考方法测量中各分量的相对贡献见图2。新鲜血液白细胞计数参考方法测量数据及不确定度见表3。本研究新鲜血液白细胞计数测定结果为6.71×109/L，U=0.19×109/L(k=2)。

图2　测量中不确定度各分量相对贡献

符号不确定度分量量值单位标准不确定度相对标准不确定度frep测量的重复性 6.714×109/L0.01850.002752Vsample加样体积 80μL0.24490.003062Vdilution+Vlytic稀释体积 20.5mL0.00081890.0003995Vreaction计数体积 0.5mL0.02040.00408fc重叠计数校正 6.713×109/L0.089220.01329uc合成标准不确定度6.714×109/L0.0974/ U扩展不确定度 6.714×109/L0.19/

讨论

本研究根据GUM文件对白细胞计数参考方法进行不确定度评估，通过建立不确定度评估模型，探讨不确定度各分量对测量结果不确定度的相对贡献。由表3和图2可知，重叠计数校正、计数体积和加样体积是影响测量不确定度的主要分量。因此，对稀释液配制和测量应严加控制，确保测量结果具有较小的不确定度。其中，颗粒计数仪计数体积0.5 mL是一个固定因素，无法直接测量，只能由厂商提供数据计算。稀释细胞因素主要受移液器校准影响，也是一个固有因素，理论上可将偏差减小为零，但在实际工作中操作比较困难，这些因素应在操作中予以重视。

对测量不确定度评估是一个很细致的过程，应注意质量保证，确保检测过程稳定并受控；有合格的操作人员，对仪器和试剂进行正确的维护和校准；使用经确认的分析方法和文件化测量程序，使实验室检测结果具有溯源性。在分析影响因素中，本研究考虑了计量器、测量条件、仪器性能、空白、重复等几个分量，但未涉及分析前因素和分析后因素，如采血抽样、基体效应、干扰、质量控制、参考区间等因素。关于分析前因素和分析后因素对测量不确定度的影响尚需进一步研究探索。

随我国检验医学水平的不断提高和检验工作的日益规范以及近年来对检验标准化工作的逐渐重视，量值溯源、测量不确定度等概念受到越来越多的关注。血细胞分析溯源存在困难，鉴于国际标准化机构目前还未建立血细胞分析参考实验室网络，并且建立血细胞分析参考方法的机构和参考实验室全国还不多，除建议常规检测实验室使用定值溯源至参考方法的校准物作为溯源标准外，还可以使用溯源至参考方法的定值新鲜血作为另一条可行的溯源途径，这样有助于解决当前血细胞分析溯源的实际问题。以新鲜血作为校准物是有保存时间和条件限制的，需不同地区的比对实验室一起来承担建立溯源体系的工作。如何发挥各地比对实验室的作用，如何开展比对实验室质量管理和监督工作还在探讨中[9]。

综上所述，参考方法测定新鲜血白细胞计数的测量不确定度主要来源于重叠计数校正和加样体积因素。因此，对血样加样稀释和测定应严加控制，确保测量结果有较小的不确定度。同时，本实验室依据ICSH推荐方法建立了白细胞计数参考方法，同时建立了白细胞计数测量结果不确定度评估模型，可用于白细胞计数项目量值溯源和标准化，为常规检测系统向参考方法溯源提供有效途径。

参考文献

[1]International Standardization Organization. Guide to the expression of uncertainty in measurement[R].Geneva：ISO，1995.

[2]European chemical measurement traceability and quality improvement of network organization/chemical analysis of international traceability cooperation group. quantifying uncertainty in analytical measurement[S]. EURACHEM/CITAC，2000.

[3]International Council for Standardization in Haematology. Reference method for the enumeration of erythrocytes and leucocytes[J].Clin Lab Haematol，1994，16(2):131-138.

[4]LEWIS SM，ENGLAND JM，KUBOTA F. Coincidence correction in red blood cell counting[J].Phys Med Biol，1989，34(9):1239-1246.

[5]彭黎明，蒋能刚. 血细胞参数检测的参考方法及其应用[J].临床检验杂志，2003，21(6):369-371.

[6]中国实验室国家认可委员会. CNAS-GL06化学分析中不确定度的评估指南[M].北京:中国计量出版社，2006:6.

[7]宋颖，胡晓波，居漪，等.红细胞计数参考方法的不确定度研究[J].检验医学，2005，20(3)：185-188.

[8]JJF1059-1999测量不确定度评定与表示[S]．1999.

[9]彭明婷，谷小林，陆红，等.我国血细胞分析参考系统的建立[J]．中华检验医学杂志，2006，29(3):196-198.

(本文编辑：龚晓霖)

收稿日期：(2015-02-05)

中图分类号：

文章编号：1673-8640(2015)05-0512-05R446.1

文献标志码：ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.05.023

作者简介：郭晓俊，男，1978年生，硕士，主管技师，主要从事临床检验工作。

基金项目：上海市卫生和计划生育委会员资助项目(2013ZYJB0010)