加味温胆汤对脑缺血再灌注损伤大鼠酪氨酸蛋白激酶2与信号转导子和转录激活子3蛋白表达及细胞凋亡的影响▲

朱小晓 蒙杏泽 黎 艳 兰 菊 梁 伟 黄文川

(广西南宁市第二人民医院中医科，南宁市 530021，E-mail：zhxx78@163.com)

论著·基础研究

加味温胆汤对脑缺血再灌注损伤大鼠酪氨酸蛋白激酶2与信号转导子和转录激活子3蛋白表达及细胞凋亡的影响▲

朱小晓 蒙杏泽 黎 艳 兰 菊 梁 伟 黄文川

(广西南宁市第二人民医院中医科，南宁市 530021，E-mail：zhxx78@163.com)

目的 探讨加味温胆汤对脑缺血再灌注损伤(CIRI)大鼠酪氨酸蛋白激酶2(JAK2)与信号转导子和转录激活子3(STAT3)蛋白表达及细胞凋亡的影响。方法 选用健康雄性SD大鼠120只，随机分为4组，每组30只。正常对照组无任何干预；假手术组仅切开颈部皮肤，暴露左侧颈总动脉；脑缺血再灌注模型组、加味温胆汤治疗组均采用线栓法制备大鼠左侧大脑中动脉脑缺血再灌注模型，然后分别给予蒸馏水灌胃和加味温胆汤灌胃。分别于缺血再灌注后3、12、24、48、72 h对各组大鼠进行神经功能ZeaLonga评分并检测脑组织JAK2、STAT3蛋白表达及神经细胞凋亡情况。结果 (1)正常对照组及假手术组大鼠无神经功能缺损表现；脑缺血再灌注模型组、加味温胆汤治疗组大鼠均出现神经功能缺损，ZeaLonga评分均高于正常对照组及假手术组(P<0.05)。(2)与正常对照组、假手术组大鼠相比，各时间点脑缺血再灌注模型组、温胆汤加味治疗组大鼠磷酸化JAK2、磷酸化STAT3灰度值明显降低(P<0.05)，缺血再灌注后24 h温胆汤加味治疗组磷酸化JAK2、磷酸化STAT3灰度值表达高于脑缺血再灌注模型组(P<0.05)。(3)与正常对照组及假手术组大鼠比较，各时间点脑缺血再灌注模型组、加味温胆汤治疗组大鼠脑细胞凋亡率明显升高(P<0.05)，而缺血再灌注后24 h加味温胆汤治疗组大鼠脑细胞凋亡率低于脑缺血再灌注模型组(P<0.05)。结论 脑缺血再灌注引发JAK2、STAT3 通路激活加重神经细胞损伤和凋亡，加味温胆汤可通过抑制JAK2/STAT3通路活化减少神经细胞凋亡，从而减轻CIRI。

缺血再灌注；大脑；温胆汤；酪氨酸蛋白激酶2；信号转导子和转录激活子3；细胞凋亡

缺血性脑血管病是一种严重影响人类健康的常见病，具有发病率、死亡率、致残率、复发率高等特点。流行病学调查显示，我国脑血管病的发病率为215.8/10万，完全性卒中患病率为1 407.6/10万，短暂性脑缺血患病率为2 191.4/10万，男性死亡率为65/10万，女性为61/10万，存活者中很多患者遗留瘫痪、失语等严重残疾，给社会和家庭带来沉重的负担[1]。因此，研究缺血性脑血管病的病理生理机制，寻找适当有效的治疗及预防措施是当前医学工作者面临的迫切而艰巨的任务。脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI)是指缺血脑组织恢复血液灌注后，脑组织损伤反而加重，表现为神经损害体征和形态学改变可能会较前更加明显等。本实验观察温胆汤加味对CIRI大鼠的酪氨酸蛋白激酶2与信号转导子和转录激活子3(Janus activated kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3，JAK2/STAT3)蛋白表达及其对脑细胞凋亡的影响，探讨温胆汤加味减轻CIRI的作用机制，为临床用药提供治疗理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选用健康雄性SD大鼠120只，体质量为(300±30)g，由广西医科大学动物实验中心提供。合格证号：SCXK(桂)2014-0002，10周龄。

1.2 主要试剂 磷酸化(phospho-，p-JAKS)(Y221)PAb、p-STAT3(S727)pAb、TUNEL试剂盒、二步法免疫组化试剂盒及二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。中药温胆汤加味颗粒剂(茯苓15 g、半夏10 g、陈皮6 g、竹茹10 g、枳实10 g、甘草6 g、川芎6 g、三七3 g、黄芪15 g、水蛭 6 g)购于南宁市第二医院中药房，根据《药理实验方法》[2]换算成300 g(体重)大鼠用量：茯苓0.40 g、半夏0.27 g、陈皮0.16 g、竹茹0.27 g、枳实0.27 g、甘草0.16 g、川芎0.16 g、三七0.08 g、黄芪0.40 g、水蛭0.16 g，结合大鼠日常进水量于灌胃前将每付中药溶于4 ml蒸馏水中。

1.3 研究方法

1.3.1 实验分组：采用随机数字表法将大鼠120只分成4组，每组30只。正常对照组无任何干预；假手术组仅切开颈部皮肤，暴露左侧颈总动脉；脑缺血再灌注模型组建立缺血再灌注模型，于缺血再灌注后给予蒸馏水灌胃，2 ml/次；加味温胆汤治疗组：建立缺血再灌注模型后给予加味温胆汤灌胃2次/d。

1.3.2 缺血再灌注动物模型的制备：参考ZeaLonga线栓法[3]，用尼龙鱼线栓塞左侧大脑中动脉，建立大脑中动脉缺血模型：用10%水合氯醛0.35 ml/100 g(体重)腹腔内注射麻醉，成功后，将大鼠仰卧固定于手术台上，术区备皮，0.5%碘伏消毒，铺洞巾。取颈部正中纵切口，依次暴露颌下腺、胸锁乳突肌、肩胛舌骨肌，分别用自制小拉钩拉向两旁固定，选取左侧大脑中动脉做缺血侧，右侧为正常对照。分离左侧颈总动脉、颈外动脉及其分支甲状腺上动脉、枕动脉、颈内动脉及其分支翼腭动脉，结扎并切断颈外动脉分支甲状腺上动脉和枕动脉，需特别注意不要损伤喉上神经和喉返神经，用翼腭钩钩取翼腭动脉，3-0手术线靠近根部结扎，暂留取线头以供提拉用，于颈外动脉分出甲状腺上动脉和枕动脉后的远端(约距颈总动脉分叉处5～7 mm)，结扎颈外动脉，随后于颈内动脉和颈总动脉分别放置显微动脉夹，在颈外动脉断端距动脉分叉3 mm处的动脉壁上用显微手术剪刀侧切小口，插入备用线栓，头端至颈总动脉分叉处调整线栓走向，使其与颈内动脉呈平行线，移去颈内动脉夹，线栓至颈内动脉颅内段时迅速推进，遇轻微阻力即可，线栓插入深度约20 mm(从左颈总动脉分叉处计算，若误入翼腭动脉中尼龙鱼线插入15 mm长度即有阻力，不能继续插入)，即可阻断左侧大脑中动脉，引起左侧大脑中动脉阻断。然后扎紧颈外动脉，以防线栓移位及出血，血管外留线约10 mm，移去颈总动脉夹，观察无渗血，缝合皮肤。缺血2 h后再灌注：抽出尼龙鱼线，使其头端退回到颈外动脉主干内，恢复左侧大脑中动脉供血，若动物已清醒则需再次麻醉，以防拔线时动物挣扎而引起血管破裂。将麻醉苏醒后的大鼠放回鼠笼，单笼饲养，自由饮食。

1.3.3 神经功能评分：(1)一般行为观察：分别于术后3、12、24、48、72 h观察神经系统症状，肢体瘫痪、转圈等，并作提尾悬空试验。有痉挛和意识障碍的大鼠则剔除。(2)参考大脑中动脉局灶缺血模型神经功能ZeaLonga评分[3]标准：0分：无神经损伤症状；1分：不能完全伸展对侧前爪；2分：向对侧转圈；3分：向对侧倾斜；4分：不能自发行走，意识丧失。

1.3.4 脑标本采集：分别于缺血再灌注后3、12、24、48、72 h，每组各处死6只大鼠，快速断头取脑，置于冰盘上，取大脑半球顶叶皮质及海马脑组织，用4%多聚甲醛/0.1M磷酸缓冲盐溶液(phosphate-buffered saline，PBS)固定液固定2 h后常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋，待切片用。

1.3.5 检测脑组织JAK2、STAT3蛋白表达：采用免疫组织化学染色法检测。将蜡块冠状切片，每张切片厚约 2 μm，切片后依次捞片，烤片12 h，脱蜡(二甲苯10 min→二甲苯10 min→二甲苯10 min→无水酒精2 min→无水酒精2 min→90%乙醇2 min→70%乙醇2 min→3%双氧水15 min→蒸馏水3 min)；PBS洗3次，2 min/次，热修复约2 min，PBS洗3次，2 min/次，血清封闭后室温放置15 min，加抗体，釆用免疫组化法(SV002兔-IgG-两步法)检测p-JAK2和p-STAT3的蛋白表达，以p-JAK2和p-STAT3蛋白表达情况来表示JAK2、STAT3蛋白表达水平；操作步骤按照试剂盒说明书进行。封片后于显微镜下观察，细胞胞浆、胞核染为棕褐色或有棕褐色颗粒沉积者为p-JAK2蛋白阳性表达，以细胞核染为棕褐色或有棕褐色颗粒沉积者为p-STAT3蛋白阳性表达。用BI-2000医学图像分析系统测量阳性细胞的平均灰度值，其灰度值与p-JAK2、p-STAT3免疫阳性细胞数成反比。

1.3.6 细胞凋亡检测：将石蜡包埋后冠状切片，厚约2 μm，切片后，捞片，烤片12 h，脱蜡；切片中加入用PBS溶液稀释过蛋白酶K，用37℃的孵箱孵育10 min后，再用PBS溶液洗3次，5 min/次；然后每张切片中加入标记缓冲液20 μl左右，保证液体覆盖住脑组织切片，防止脑组织干片。然后按1 ∶20配置末端脱氧核苷酸转移酶与地高辛标记液，将其混匀。再除去切片上多余的液体，重新给每张片加标记液，加完后将切片放在湿盒中，用37℃的恒温箱孵育2 h，PBS溶液洗3次，3 min/次；加封闭液，确保封闭液覆盖住脑组织切片，放在室温下，30 min；甩掉脑组织切片表面的封闭液，脑组织切片上加入提前配好的抗地高辛抗体溶液，将有脑组织的载玻片放在湿盒中，用37℃的孵箱孵育30 min，PBS溶液洗3次，3 min/次，加提前配好的链霉亲和素-生物复合物溶液，37℃孵育30 min，PBS溶液洗5次，4 min/次，DAB显色，显色需在暗室内，显色完毕后需用水洗，用苏木素复染，蒸馏水洗，透明，封片，显微镜观察。细胞的胞核被染为棕黄色或有棕黄色颗粒沉积者则为凋亡细胞。以400倍镜视野的显微镜为标准，每张标本片中选5个不重复的视野，且计算出每个视野内的阳性细胞数，算出凋亡细胞数占总细胞数的百分比。

1.4 统计学分析 应用SPSS 13.0软件进行统计分析，计量资料以(x±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠神经功能评分比较 正常对照组、假手术组未出现神经功能缺损症状，各时间点神经功能ZeaLonga评分均为0分。脑缺血再灌注模型组、加味温胆汤治疗组大鼠在术后3、12、24、48、72 h均出现不同程度的肢体活动障碍，精神状态差，进食及活动均减少，与正常对照组、假手术组比较，脑缺血再灌注模型组、加味温胆汤治疗组大鼠神经功能缺损ZeaLong评分明显升高(P<0.05)；各时间点，脑缺血再灌注模型组大鼠与加味温胆汤治疗组大鼠的神经功能缺损评分比较，差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 缺血再灌注后不同时点各组神经功能评分比较(x±s，分)

注： 与正常对照组、假手术组比较，*P<0.05。

2.2 各组大鼠脑组织p-JAK2、STAT3灰度值比较 与正常对照组、假手术组大鼠相比，脑缺血再灌注模型组、温胆汤加味治疗组大鼠p-JAK2、p-STAT3灰度值明显降低(P<0.05)；缺血灌注后24 h温胆汤加味治疗组p-JAK2、p-STAT3灰度值表达高于脑缺血再灌注模型组(P<0.05)。见表2、表3。

表2 缺血再灌注后不同时点各组JAK2灰度值(x±s)

注：与正常对照组、假手术组比较，*P<0.05；与脑缺血再灌注模型组比较，▲P<0.05。

表3 缺血再灌注后不同时点各组p-STAT3灰度值(x±s)

注：与正常对照组、假手术组比较，*P<0.05；与脑缺血再灌注模型组比较，▲P<0.05。

2.3 各组细胞凋亡率比较 与正常对照组及假手术组大鼠比较，脑缺血再灌注模型组、加味温胆汤治疗组大鼠脑细胞凋亡率明显升高(P<0.05)，而加味温胆汤治疗组大鼠脑细胞凋亡率低于脑缺血再灌注模型组(P<0.05)。见表4。

表4 缺血再灌注后不同时点各组脑细胞凋亡率比较(x±s，%)

注：与正常对照组、假手术组比较，*P<0.05；与脑缺血再灌注模型组比较，▲P<0.05。

3 讨 论

CIRI是一个快速的级联反应，这个级联反应包括许多环节，可能与氧化应激反应、炎症反应、能量代谢障碍、兴奋性氨基酸毒性作用、钙超载、细胞凋亡等有关。这些环节互为因果，彼此重叠，并相互联系，形成恶性循环，最终导致细胞凋亡或坏死。已有研究证实，CIRI后诱导许多细胞因子和炎性介质，并在脑缺血病理生理中扮演着重要角色，其中包括白细胞介素-6、白细胞介素-1、肿瘤坏死因子-α等[4]。脑缺血开启了细胞的一系列级联反应事件，包括不同的信号通路，最终引起不可逆的脑组织损伤，导致脑梗死。脑细胞缺氧后产生大量自由基，对细胞造成了氧化应激损伤。再灌注可提供营养物质和氧气，但同时也使神经细胞炎症级联反应加重，使脑细胞受损严重。氧化损伤、免疫炎症介质释放、神经营养因子缺失与释放、钙超载等都与CIRI病程及损伤程度密切相关，是CIRI后致畸致残的主要原因。

近年研究表明JAK/STAT信号转导途径参与中枢神经系统的发育以及神经细胞的增殖、生存、分化过程[5]，且该信号途径活化是加重CIRI的病理生理机制之一。故抑制该通路异常活化可能是减轻CIRI的一个重要策略。JAK/STAT 通路的作用是将细胞外信号传递到细胞核，进而调节细胞核内转录引发生物学效应[6]。研究表明大鼠CIRI侧脑组织额顶叶皮质及纹状体p-JAK2、p-STAT3表达明显增高，并且与神经凋亡细胞数呈正相关，说明脑缺血再灌注后JAK2、STAT3被激活，活化的STAT3渐移向核内，与目的基因的启动子结合，直接激活目的基因表达[5]。Suzuki等[7]观察SD大鼠局灶性脑缺再灌注损伤后p-STAT3蛋白在脑组织中表达的变化，结果发现缺血再灌注后3 h在缺血皮层及纹状体神经元可检测到p-STAT3蛋白表达；再灌注损伤24 h后p-STAT3蛋白在缺血半暗带区显著增多并达高峰；此后随着再灌注时间延长p-STAT3蛋白表达渐减少。Wen等[8]的研究表明CIRI后引发JAK2/STAT3通路激活及表达增多与神经细胞损伤和凋亡有关，故抑制该通路活化可成为临床治疗CIRI的理论基础。

自拟方加味温胆汤(茯苓、半夏、陈皮、竹茹、枳实、甘草、川芎、三七、黄芪、水蛭)是在温胆汤的基础上加川芎、三七、水蛭等活血化瘀中药组成，有化痰祛湿、活血通络的作用，临床上常用于缺血性卒中的治疗。蒋敏[9]发现加味温胆汤可促进缺血脑组织血管新生从而改善脑缺血再灌注大鼠的神经功能。王蓓[10]则发现黄芪和三七可通过抑制JAK、STAT通路激活而有效对抗CIRI。本实验通过建立脑缺血再灌注模型，发现CIRI大鼠JAK2/STAT3蛋白表达增高，神经凋亡细胞增多，于24 h达峰值，后逐渐逐渐降低。用加味温胆汤干预后，在脑缺血再灌注后24 h时JAK2/STAT蛋白较脑缺血再灌注模型组表达明显减少，同时神经细胞凋亡亦明显减少。提示加味温胆汤可通过抑制JAK2/STAT3通路减少神经细胞凋亡，从而减轻CIRI。

综上所述，加味温胆汤可通过多种机制发挥对抗CIRI的作用，本实验研究证明，抑制JAK2/STAT3通路活化可能是其减轻CIRI的机制之一。

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[2] 徐叔云,卞如濂,陈 修.药理实验方法学[M].第5版.北京:人民卫生出版社,2008:202-204.

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[9] 蒋 敏.加味温胆汤对MCAO模型大鼠神经功能缺失及血管新生的影响[J].生物技术世界,2014(5):57-58.

[10] 王 蓓.黄芪和三七主要成分抗脑缺血的配伍及对能量代谢和JAK/STAT信号通路的影响[D].长沙:湖南中医药大学,2013.

Effect of Jiaweiwendan Decoction on expressions of janus activated kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3 proteins and cell apoptosis in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury

ZHUXiao-xiao,MENGXing-ze,LIYan,LANJu,LIANGWei,HUANGWen-chuan

(DepartmentofTraditionalChineseMedicine,theSecondPeople′sHospitalofNanning,Nanning530021,China)

Objective To investigate the effect of Jiaweiwendan Decoction on the expressions of janus activated kinase 2(JAK2)/signal transducer and activator of transcription 3(STAT3) proteins and cell apoptosis in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury.Methods A total of 120 healthy male SD rats were randomly divided into 4 groups,with 30 rats in each group.No intervention was conducted in the normal control group.In the sham-operation group,an incision was performed in the neck skin and left common carotid artery was exposed.Rat models of left middle cerebral artery ischemia-reperfusion injury were established using suture embolization method in the cerebral ischemia-reperfusion group and Jiaweiwendan Decoction group.Intragastric administration with distilled water and Jiaweiwendan Decoction were performed in the cerebral ischemia-reperfusion group and Jiaweiwendan Decoction group respectively.At 3,12,24,48 and 72 hours after ischemia-reperfusion,Zealonga score for neurological function was assessed,the expressions of JAK2/STAT3 proteins and nerve cell apoptosis were detected in each group.Results ① No neurological function impairment was found in the normal control group and sham-operation group.In the cerebral ischemia-reperfusion group and Jiaweiwendan Decoction group,neurological function impairment was observed,and the Zealonga scores were significantly higher compared to the normal control group and sham-operation group(P<0.05).② At each time point,the cerebral ischemia-reperfusion group and Jiaweiwendan Decoction group obtained significantly lower gray values of JAK2 and STAT3 compared to the normal control group or sham-operation group(P<0.05),and the gray values of JAK2 and STAT3 in the Jiaweiwendan Decoction group were higher than those in the cerebral ischemia-reperfusion group(P<0.05).③ At each time point,the cerebral ischemia-reperfusion group and Jiaweiwendan Decoction group obtained significantly higher apoptosis rate of brain cells compared to the normal control group or sham-operation group(P<0.05),and the apoptosis rate in the Jiaweiwendan Decoction group were lower than that in the cerebral ischemia-reperfusion group(P<0.05).Conclusion Cerebral ischemia-reperfusion can activate the JAK2/STAT3 pathway and then aggravates the injury and apoptosis of brain cells.Jiaweiwendan Decoction can reduce the cell apoptosis by suppressing the activation of JAK2/STAT3 pathway,and then alleviates the cerebral ischemia-reperfusion injury.

Ischemia-reperfusion,Brain,Jiaweiwendan Decoction,Janus activated kinase 2,Signal transducer and activator of transcription 3,Apoptosis

广西南宁市科技攻关计划(ZC20133004)

朱小晓(1964～)，女，本科，主任医师，研究方向：中医心脑血管疾病。

R 743.31

A

0253-4304(2016)07-0906-05

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.07.03

2016-02-29

2016-05-13)