线粒体荧光探针最新研究进展

姜娜，樊江莉，杨洪宝，彭孝军

（1大连理工大学精细化工国家重点实验室，辽宁 大连 116024；2济南大学化学化工学院，山东 济南 250022）



线粒体荧光探针最新研究进展

姜娜1,2，樊江莉1，杨洪宝1，彭孝军1

（1大连理工大学精细化工国家重点实验室，辽宁 大连 116024；2济南大学化学化工学院，山东 济南 250022）

摘要：细胞器的研究一直是认识细胞结构和功能的重要手段。线粒体是细胞的能量工厂，参与众多的新陈代谢过程，许多病理学过程均与它相关，是一种重要的细胞器，一直以来都是研究的热点。定位于线粒体的荧光探针主要分为3大类，本文重点介绍并讨论近10年基于带有正电荷的荧光团或者在荧光团中引入三苯基膦等定位基团实现对线粒体染色荧光探针的研究进展。

关键词：荧光；探针；线粒体；细胞生物学；生物技术；成像

2015-06-29收到初稿，2015-07-31收到修改稿。

联系人：彭孝军。第一作者：姜娜（1987—），女，博士研究生。

Received date: 2015-06-29.

引 言

线粒体是细胞的能量工厂，在细胞生命过程中起到至关重要的作用，其功能异常与许多疾病密切相关，因此开发线粒体相关的荧光探针具有重要的生物学和生理学意义。目前已报道的定位于线粒体的荧光探针主要分为3大类：一类是基于线粒体带有-180 mV的膜电位，进而利用本身带有正电荷的荧光团或者在荧光团中引入三苯基膦等正电荷基团来实现其对线粒体的染色；另一类是将探针与能够标记线粒体的蛋白质或者短肽链连接（一般由20～40个氨基酸序列组成），进而达到线粒体特异性染色的目的。这类探针具有较好的生物相容性，但水溶性差、细胞通透性不好等限制其应用发展；第3类是利用胶束或者囊泡将药物等不能够渗透线粒体膜的物质包裹，进而选择性堆积在线粒体。一般选用带有正电荷的脂质体等作为囊泡的外表面，通过内吞作用，磷脂层与线粒体膜相融合后释放内含物。该类探针能够将带负电的药物或者大分子协同带入线粒体内部，但是内含物的释放率是值得关注的方面。本文将着重讨论第一类荧光探针近10年的发展。

1 线粒体成像类荧光探针

线粒体是1894年德国科学家Altmann在动物细胞内首次发现的，它具有双层膜结构，外膜是界膜，内膜向内折入形成嵴；内外膜不相通，形成约-180 mV的膜电位。目前大多数线粒体定位类荧光探针是基于线粒体负膜电位特性，利用本身带有正电荷的荧光团或者在荧光团中引入带有正电荷基团，实现对线粒体的染色，其中最为常用的是三苯基膦正电荷基团。线粒体不仅为人体生命活动提供能量，还积极参与多种生理过程，它的异常与癌症、糖尿病、阿尔茨海默病等疾病相关，同时线粒体对各种外界损伤又极为敏感，通常其数量、大小和结构随损伤均有改变。细胞受到损伤时，线粒体可由线状变大或者变圆，损伤严重时可变成小空心泡状结构。2013年，本课题组合成一例能够长时间观测线粒体形态变化的氟硼吡咯类（BODIPY类）荧光探针OBEP（1.1）（图1）[1]。该探针具有良好的光学稳定性，小的细胞毒性，在生理pH范围内对酸碱不敏感，可以通过激光共聚焦成像观测到处于不同形态的线粒体。通过探究，作者认为探针（1.1）是基于吡啶N原子乙基季铵化后使得探针整体带正电荷，易于与线粒体负的膜电位相结合进而特异性染色到线粒体。

图1 探针1.1的分子结构及其对活细胞中不同损伤程度线粒体的荧光成像Fig.1 Structure of probe 1.1, and confocal fluorescence image for various damaged mitochondrial forms in living cells

图2 探针1.2和1.3的分子结构及其对活细胞中线粒体的荧光成像Fig.2 Structures of probes 1.2 and 1.3, and fluorescent images of them for mitochondria in living cells

近红外荧光探针可以有效地避开蛋白自发荧光，具有较深的组织穿透力，因此开发能够定位于线粒体的近红外荧光探针意义重大。2010年Shi课题组证实以吲哚季铵盐为基础的七甲川菁染料可以定位于线粒体[2]。由于探针IR-780（1.2）（图2）具有较好的光学性质和生物相容性，优先聚集于肿瘤组织，因此作者希望可以利用该探针建立一个肿瘤诊断和治疗的平台。2013年Tung课题组报道一例基于七甲川菁染料的无细胞毒性探针AcQCy7 （1.3）（图2）[3]，该探针本身不发射荧光，当进入细胞后发生乙酰基水解作用生成化合物QCy7，同时伴随红色荧光发射。分子1.3可以很好地选择性堆积在线粒体上，即使与细胞共孵育时间长达两天，其染色位置不变，而且无任何细胞毒性表达，这为长时间观测线粒体形态变化提供有利的研究工具。

2011年 Kawazoe课题组报道首例成像于线粒体膜的荧光探针[4]，并且通过细胞磨碎技术、凝胶电泳、液质联用技术等各种实验证明该分子在膜上发生成环反应，由本身没有荧光的分子1（1.4）在线粒体膜上反应生成发射绿色荧光的分子2（1.5）（结构如图3），但是该分子定位于线粒体膜及其环化反应的机制尚不明确。

图3 探针1.4和1.5的分子结构及其对活细胞中线粒体的荧光成像Fig.3 Structures of probes 1.4 and 1.5, and confocal images of HeLa cells

双光子激光共聚焦成像由于具有高的空间分辨率、组织穿透性深、光损伤程度低和耐光性好等优点，目前受到广泛关注。山东大学于晓强教授基于咔唑母体，设计合成两例用于线粒体成像的双光子荧光探针CAI（1.6）和CAEI（1.7）（图4）[5]。这两例探针之所以能够定位于线粒体，很大部分是因为吡啶被碘代烷化合物取代后形成季铵盐，使探针分子带有正电荷。

目前已报道的能够定位于线粒体的荧光探针大部分是基于三苯基膦基团或者探针本身带有正电荷，而2013年Reddy及其合作者报道一例基于铕-β二酮络合物用于线粒体定位的探针Eu(pfppd)3(tpy) （1.8）（图5）[6]，丰富了线粒体荧光探针的数据库。

图4 探针1.6和1.7的分子结构及其对活细胞中线粒体的荧光成像Fig.4 Structures of probes 1.6 and 1.7, and fluorescent images of them for mitochondria in living cells

图5 探针1.8的分子结构及其与商品化线粒体染料在H9c2细胞中线粒体的荧光成像Fig.5 Structure of probe 1.8, and confocal images of H9c2 cells treated with Mitochondria tracker CellLight™Mitochondria-GFP BacMam 2.0 or molecule 1.8

2 线粒体内离子类荧光探针

锌作为一种重要的过渡金属元素，在人体中的含量仅次于铁，Zn2+含量异常会影响相关蛋白以及DNA的转化和功能，进一步影响正常生理过程，造成脑发育迟缓、癫痫等疾病。2003年Gee课题组报道一例基于罗丹明的探针RhodZin-3 AM（2.1）（图6）[7]，该探针与Zn2+结合后可实现75倍荧光增强，并且选择性堆积于线粒体上，实现对线粒体中内源性自由Zn2+的检测。2011年，韩国Cho课题组报道一例基于FRET机理检测线粒体内Zn2+的红色荧光探针5[8]。该探针斯托克斯位移大，可减少激发光的干扰，在生理范围内不受pH干扰，实现了Zn2+的比率成像。紧接着，2012年，Cho和Kim合作，利用三苯基膦基团对线粒体的定位作用合成一例检测Zn2+的双光子荧光探针SZn2-Mito（2.2）（图6）[9]。当与Zn2+结合后，探针536 nm处有70倍荧光增强，对鼠海马组织深达100～200 μm处实现Zn2+双光子激光共聚焦成像。

图6 探针2.1和2.2的分子结构及其分别与相对应的线粒体商品化染料在活细胞中线粒体的共定位荧光成像Fig.6 Structures of probes 2.1 and 2.2, and co-localization of 2.1 and MitoTracker Green, and confocal images of HeLa cells treated 2.2 or Mitotracker Red FM

铁是人体内含量最多的过渡金属元素，具有重要的生理学意义，包括呼吸作用、电子转移、遗传信息转录等。尤其在线粒体内，铁含量异常所引起的相关疾病正在增加，例如弗里德里奇共济失调症。这种疾病是由共济蛋白的缺陷引起的，而三价铁离子是这种蛋白合成的控制因素。大连理工大学宁桂玲教授带领课题组设计合成一例基于罗丹明探针母体用于检测细胞内三价铁离子的探针RNP1（2.3）（图7）[10]，该探针基于萘酐与罗丹明之间发生FRET作用调节对Fe3+的络合能力。值得注意的是，探针2.3定位于线粒体同样是依赖于三苯基膦基团。Cabantchik课题组同样通过修饰罗丹明母体来监测线粒体内Fe3+水平[11-14]RdITPA-TG（图8）[15]。该系列探针在中性环境下选择性与Cu+反应，使得母体螺环打开，发射542 nm的黄橙色荧光。当TG基团为三苯基膦基团时，探针2.4可很好地定位于线粒体上，达到对线粒体内。

图7 探针2.3的分子结构及与商品化线粒体绿色染料在HeLa细胞中共定位实验Fig.7 Structure of 2.3, and localization of MitoTracker Green FM or 2.3 in HeLa cells

图8 探针2.4的分子结构Fig.8 Structure of probe 2.4

图9 分子2.5-a和2.5-b由零价钯催化发生铃木反应生成2.5的过程[16]Fig.9 Pd0-mediated Suzuki-Miyaura cross-coupling reaction for synthesis of anthofluorescein 2.5 from 2.5-a and 2.5-b[16]

铜同样是线粒体内重要的基本金属元素，参与线粒体细胞色素c氧化酶及超氧歧化酶的合成，而这两种酶在能量产生和能量凋亡中起调配作用。Taki教授基于香豆素母体设计合成一系列探针Cu+检测识别的目的。

钯及其离子化合物在生物体内含量很低，大多数是通过呼吸作用吸入，进而滞留在肺部，其中一部分吸收的钯化合物会快速转运至肝、肾等器官。但是由于环境中钯离子的浓度很低，又存在基体干扰，因此对它的检测分析仍较为困难。Bradley及其合作者利用细胞内的耦合反应合成化合物5（2.5）（图9）[16-17]。首先脂溶性不能够发射荧光的探针母体2.5-a与带有三苯基膦部分的2.5-b部分进入细胞后，在Pd0的催化作用下发生铃木反应生成探针2.5，同时伴随着绿色荧光的发射，而三苯基膦基团的引入，使得探针可以定位于线粒体。

氟离子是一种重要的阴离子，它广泛地参与生物、医药和化学过程。当人体氟离子含量超标时，最常见的表现是氟斑牙、新陈代谢失调、骨质疏松症和尿石症等。研究表明，当线粒体暴露在高浓度的氟离子环境时，其呼吸作用效率下降，进而导致线粒体功能紊乱，诱发迟发性神经退行性类疾病。2014年，本课题组设计合成一例高选择性和高灵敏性检查F-的荧光探针FP（2.6）（图10）[18-19]。分子2.6本身不发射荧光，当与F-发生水解作用后，将会在485 nm处发射强烈的绿色荧光，且对F-的检测限达19×10-9mol·L-1。该探针虽不带有正电荷（与F-作用后的产物YG也不带正电荷），却很好地选择性定位于活细胞线粒体上。

图10 探针2.6的分子结构及其对活细胞中线粒体的荧光成像Fig.10 Structure of probe 2.6, and its fluorescent images for mitochondria in living cells

图11 探针3.1和3.2的分子结构以及探针3.2对HeLa细胞内线粒体选择性染色Fig.11 Structures of probes 3.1 and 3.2, and localization of 3.2 in mitochondria in HeLa cells

3 线粒体内活性氧类荧光探针

氧气是生物进行生命活动的必要因素。在生命活动中，机体通过呼吸作用产生一系列氧的衍生物，例如活性氧系列，通常包括超氧负离子（O-2·）、羟基自由基（HO·）、过氧自由基（ROO·）、过氧化氢（H2O2）和单线态氧（1O2）等。在正常的细胞环境内，活性氧的产生是必须的，但是当因外界刺激产生过量的活性氧时，可对机体造成损伤乃至损害[20]。早在2006年，Chang课题组合成一例基于FRET机理比率检测过氧化氢的新型荧光探针RPF1（3.1）（图11）[21]。未与H2O2反应前，只能观察到香豆素的蓝色荧光；与H2O2相互作用后，香豆素的蓝色荧光逐渐减弱，而荧光素的绿色荧光恢复并且逐渐增强。探针RPF1（3.1）激发和发射波长均处于可见光区，不仅可减少对生物样品的光损伤，还可以避开蛋白的自发荧光。值得注意的是，作者是将线粒体从细胞分离出后进行的检测。紧接着，2007年Nagano课题组基于罗丹明母体带有正电荷的性质，设计合成一例真正能够检测线粒体中活性氧的探针MitoAR（3.2）（图11）[22]，并实现在活细胞中对活性氧的荧光成像。

2010年，Shioji课题组将三苯基膦基团引入到四苯基芘荧光母体上，报道一例能够检测线粒体内过氧化合物的探针MitoDPPP（3.3）（图12）[23]。通过观察探针的染色情况，作者认为脂溶性的过氧化合物可有效地穿透线粒体膜。Robinson及其合作者同样将三苯基膦基团引到乙啡啶母体上，合成能够定位于线粒体的探针6（3.4）和7（3.5）（图12）[24]。这两例探针的荧光发射具有不同的形式。当细胞内仅发生自动氧化作用（无超氧化合物）时，探针510 nm激发时只产生乙啡啶部分的荧光；而当超氧化合物存在时，它将氧化探针生成2-羟基-乙啡啶的形式，并且在396 nm和510 nm处均可被激发，因此通过检测396 nm和510 nm两处的激发波长，可区分细胞一般氧化过程和超氧诱导过程。

2014年，新加坡国立大学的刘斌教授，通过三苯基膦基团的线粒体定位功能，很巧妙地利用癌细胞的线粒体膜电位比正常细胞更负，设计合成一例聚集态发光的探针AIE-mito-TPP（3.6）（图13）[25]。该探针可以选择性堆积在癌细胞中的线粒体上，并且通过探针的聚集达到荧光从无到有的过程。另外探针的进一步堆积可以诱导线粒体产生更多的活性氧，达到杀死癌细胞的目的。

图12 探针3.3～3.5的分子结构Fig.12 Structures of probes 3.3—3.5

次氯酸和次氯酸根是常见的活性氧物种，在日常生活中，次氯酸一般被用于漂白织物。在生物体内，次氯酸一般存在于白细胞内，经过氧化氢和氯化物在过氧化物酶的催化作用下产生，次氯酸本身具有一定的防御功能，可以杀死多种病原体。当细胞内次氯酸含量异常时，动脉粥样硬化、关节炎、风湿性关节炎和肺部炎症等疾病都有可能产生。基于三苯基膦基团的线粒体定位功能，本课题组程光辉博士将其引入到BODIPY母体上，基于肟的还原反应合成一例对次氯酸根快速响应的荧光探针MitoClO（3.7）（图14）[26]。测试体系中加入次氯酸根后，溶液由粉红色变为黄色，肉眼可见，伴随着绿色荧光的发射，并且探针3.7可对线粒体内次氯酸根进行共聚焦成像。

2014年，四川大学李坤副教授和余孝其教授合作，合成两例基于罗丹明母体用于检测细胞内源性次氯酸的荧光探针Rh-TPP（3.8）和Rh-Py（3.9）（图15）[27]。其中探针3.8由于三苯基膦基团的引入，使得它能够定位于活细胞中的线粒体，并且对线粒体中次氯酸的含量可通过共聚焦成像。

生物体内的过氧硝酸根一般认为是在酶的催化作用下由一氧化氮和超氧化物形成的。过氧硝酸根与蛋白质、磷脂、核酸等的合成密切相关。研究认为阿尔茨海默病、关节炎、癌症、自身免疫缺陷病等均与过氧硝酸根含量的异常相关。2015年山西大学郭炜教授基于罗丹明母体合成探针1（3.10）（图16）[28]。该探针可排除其他活性氧物种，只对过氧硝酸根响应，荧光由无到明亮绿色，并且响应快速（几秒内即可完成响应）。该探针定位于线粒体是基于罗丹明母体带有正电荷的性质。

图13 探针3.6的分子结构及其对活细胞中线粒体的荧光成像[25]Fig.13 Structure of probe 3.6, and diagram of apoptosis was induced by 3.6[25]

图14 探针3.7的分子结构及其与商品化线粒体深红色染料在MCF-7细胞中共定位荧光成像Fig.14 Structure of probe 3.7, and confocal images of 3.7 or a mitochondria-specific probe MitoTracker Deep Red FM in MCF-7

图15 探针3.8和3.9的分子结构及其对活细胞中线粒体的荧光成像Fig.15 Structures of probes 3.8 and 3.8, and fluorescent images of them for mitochondria in living cells

4 线粒体内有机小分子类荧光探针

硫化氢是一种有臭鸡蛋味的无色气体，是继一氧化碳、一氧化氮后，人体内存在的第3种内源性气体。在血管舒张、抗氧化作用、抗细胞凋亡和抗炎症等生理过程中，硫化氢起着举足轻重的作用，它含量异常与阿尔茨海默病、唐氏综合征等息息相关。2013年，南京大学郭子建教授带领团队，将香豆素和半菁探针结合，设计合成一例超快速（30 s之内完成检测）比率检测线粒体内硫化氢的荧光探针CouMC（4.1）（图17）[29-30]。由于探针本身带有一个正电荷，因此无需额外引入其他线粒体定位基团便可很好地染色于线粒体上。探针4.1本身只在652 nm处发射强烈的红色荧光，当与硫化氢作用后，652 nm处荧光强度不断降低，510 nm处产生一个新的绿色荧光，随着硫化氢浓度的增加该荧光强度不断增强，实现对硫化氢的比率检测。

图16 探针3.10的分子结构及其与商品化红光线粒体染料在BIU-87细胞中激光共聚焦成像Fig.16 Structure of probe 3.10, and fluorescence images of 3.10 and MitoTracker Red FM in BIU-87 cells

图17 探针4.1的分子结构及其与商品化线粒体红色荧光染料在MCF-7细胞中共定位成像Fig.17 Structure of probe 4.1, and confocal fluorescence images of MCF-7 cells costained by 4.1 and Mito tracker Deep Red

硫醇类化合物在细胞内氧化还原、细胞凋亡、DNA合成和血管形成等过程中起着重要的调控作用。谷胱甘肽和硫醇还蛋白是细胞内最重要的两大类硫醇类化合物。硫醇还蛋白的功能主要体现在蛋白质二硫键的去除上，例如核苷酸还原酶、甲硫氨酸还原酶和过氧化还原酶等。然而，过量的硫醇还蛋白将会引起癌症及心血管疾病。韩国Kim教授于2012年在J. Am. Chem. Soc. 杂志上发表一篇基于萘酰亚胺母体来检测线粒体内硫醇还蛋白的荧光探针Mito-Naph（4.2）（图18）[31]。作者的设计思想很明确，即一方面通过二硫键的去除来识别硫醇还蛋白，另一方面利用三苯基膦基团的正电荷特性来定位于线粒体。探针4.2本身不发射荧光，当与硫醇还蛋白类物质作用后，发射出强烈的绿色荧光（λem= 540 nm），检测限可达50 nmol·L-1。基于该平台，陆续又有该类探针被报道[32-34]。

尽管许多检测线粒体硫醇化合物的探针是基于二硫键的去除或者迈克尔加成反应设计的，但是一例能够用于单独检测线粒体内谷胱甘肽的近红外荧光探针MitoGP（4.3）（图19）[35]。菁探针本身带有一个正电荷，因此该探针可以选择性定位于线粒体；而七甲川菁探针中位氧-对氨基类化合物的取代，使得该探针对谷胱甘肽的选择性大大高于半胱氨酸和高半胱氨酸，这正是该工作的亮点。

2011年，Miyata等报道首例能够诱导线粒体产生一氧化氮的荧光探针RpNO（4.4）（图）[36]，该探针可用于研究生物体一氧化氮的生物学及生理学意义。探针4.4之所以能够定位于线粒体也是基于罗丹明母体带有正电荷的性质。紧接着该课题组又报道一例能够光致释放一氧化氮的荧光探针NBDNO（4.5）（图20）[37]。不同的是，该探针是利用三苯基膦基团的正电荷性质定位到线粒体。

图18 探针4.2的分子结构及其对活细胞中线粒体的荧光成像Fig.18 Structure of probe 4.2 and its fluorescent images for mitochondria in living cells

5 线粒体内酸碱环境荧光探针

图19 探针4.3的分子结构及其对线粒体中谷胱甘肽响应Fig.19 Structure of probe 4.3, and glutathione detection in mitochondria

线粒体许多功能是依赖于其酸碱性来实现的，例如正常生理状态下，基于呼吸作用将质子由线粒体内膜传输到线粒体外膜，因此线粒体基质会处于碱性环境（pH约为8）。当线粒体酸化时，将会发生自噬过程进而诱导一系列疾病的产生。2014年，Kim课题组设计合成一例用于实时检测线粒体pH的探针1（5.1）（图21）[38]。由于哌嗪基团上的N原子可对萘酰亚胺母体发生PET作用，因此探针本身无荧光；而当N原子与H+结合后，PET作用消失，探针发射出525 nm的绿色荧光。三苯基膦基大多数探针是不能够将谷胱甘肽与半胱氨酸和高半胱氨酸进行区分的。2014年Kang课题组设计合成团的引入使得该探针可以很好地定位于线粒体上。通过细胞饥饿实验，可以明显地观察到线粒体pH的变化与其酸化和融合等是相互依赖的。作者推论利用该探针检测线粒体pH的异常将会对疾病的发现和诊断提供方便，但是该探针存在发射波长较短的不足。于是2014年山东师范大学唐波教授合成探针Spring Red（5.2）（图21）[39]。探针5.2发射波长达到660 nm，属于近红外区，可有效地避开生物组织的本体荧光，利于实际应用。

图20 探针4.4和4.5的分子结构及其对活细胞中线粒体的荧光成像Fig.20 Structures of probes 4.4 and 4.5, and fluorescent images of them for mitochondria in living cells

图21 探针5.1和5.2的分子结构及5.2对HepG2细胞中线粒体不同酸碱环境的荧光成像Fig.21 Structures of probes 5.1 and 5.2, and fluorescent confocal microscopy images of 5.2 in HepG2 cells defined at pH 4.0—8.5

相比单一强度检测的探针，比率荧光检测具有两个以上发射峰，相对来说每个发射峰不受探针浓度影响，荧光强度及比值能够提供更多的信息，具有抗干扰能力强等优点。2015年李坤副教授和余孝其教授合作，合成一例基于香豆素母体通过比率方法检测线粒体pH的荧光探针CP（5.3）（图22）[40]。水溶性探针5.3对pH非常敏感，而对细胞内的阳离子、阴离子、反应类硫醇化合物和单线态氧等均无响应，可实时监测因细胞凋亡、药物刺激等引起的线粒体酸化过程中线粒体pH的变化，这为定量线粒体pH提供有利的工具。

6 检测线粒体内黏度的荧光探针

细胞内黏度在信号传递、核功能化、染色质定位、单线态氧的定位等生物过程中起着十分重要的作用[41-42]。细胞内黏度的突然变化会导致相关的功能化缺陷和疾病。线粒体是细胞的能量制造工厂，它对癌症、阿尔茨海默病、帕金森综合征等疾病都有着敏感的响应。线粒体膜黏度的降低，电子传输链活性的减弱，活性氧含量的增加，细胞色素c释放量的增加等均可以引起线粒体功能损伤[43]，因此检测活细胞内线粒体内黏度具有重要的医学和生物学意义。

图23 探针6.1和6.2的分子结构及其与商品化线粒体染料的复染实验Fig.23 Structures of probe 6.1 and 6.2, and fluorescent images of them for mitochondria in living cells

2013年，本课题组基于香豆素和BODIPY探针，合成一例自校准的黏度探针1（6.1）（图23）[44]，在设计阶段作者将三苯基膦基团引入，使得探针可以选择性定位于活细胞的线粒体上。该工作第一次估算出HeLa细胞内线粒体的黏度值在62 mPa·s，当细胞受到离子载体、莫能菌素、制霉菌素等刺激时，线粒体黏度可升高至110 mPa·s。同年，本课题组基于咔唑设计合成一例具有双光子性能的黏度探针Caz-Cy2（6.2）（图23）[45]。该探针可以比率检测溶液黏度变化，不受极性或生物大分子的干扰，可以对线粒体内黏度进行成像。紧接着，设计合成双模式监测线粒体黏度的荧光探针Mito-V（6.3）（图24）[46]。探针6.3本身带有一个正电荷，易于定位于线粒体上，可通过荧光比率成像和荧光寿命成像两种方法来检测活细胞中线粒体黏度的变化，并且作者观察到线粒体黏度在细胞凋亡中增大的现象。

图24 探针6.3分子结构及其与商品化深绿色荧光染料在HeLa细胞中共定位荧光成像Fig.24 Structures of probe 6.3, and confocal fluorescence images of HeLa cells stained with MitoTracker Green FM and 6.3

7 检测线粒体内极性的荧光探针

在生物系统中，特别是在细胞水平上，极性的变化影响蛋白质、酶等的相互作用，并且在一定程度上反映出细胞膜的通透性。此外，它的异常变化与一些疾病密切相关，例如糖尿病、肝硬化等[47-49]。然而极性受许多复杂的因素影响，包括非共价相互作用、偶极和去偶极化作用、氢键相互作用等[50-51]。因此简单地测试细胞内的极性是十分困难的，亟需发展一种新方法。另外，细胞内有多种细胞器，每种细胞器的极性也是不同的（其他参数，例如极性、单线态氧等也不同），所以更精确地检测某一细胞器的极性具有更加明确的生物学意义[52-55]。

线粒体极性变化会强烈地影响蛋白质和生物大分子的运输和交互作用。另一方面，线粒体极性还能够在一定程度上反映该种亚细胞器的位置、形态和组件的变化等。而当线粒体功能异常时，其内部酶、蛋白质和生物大分子基质等将不能正常传输[56-57]，例如线粒体苹果酸脱氢酶的活性和稳定性会受到周围环境极性的强烈影响[58]，因此研究和开发出能够用于检测线粒体极性的荧光探针具有重要意义。2015年，本课题组设计合成一例以香豆素为基础的半菁探针BOB（7.1）（图25）[59]。该探针具有两个吸收峰和两个发射峰，随着溶液极性增加，探针在短波长与长波长处荧光强度比例与溶液极性呈线性关系，可用作比率型极性荧光探针。BOB探针可对活细胞中的线粒体进行特异性染色，发现并验证线粒体极性在细胞凋亡过程中降低，还发现线粒体极性在癌细胞中低于正常细胞，期望通过监测线粒体极性的异常来区分癌细胞和正常细胞。

图25 探针7.1的分子结构及其与商品化深绿色荧光染料在MCF-7细胞中共定位荧光成像Fig.25 Structures of probe 7.1, and confocal fluorescence images of MCF-7 cells stained with Mito Tracker Green FM and 7.1

8 结论与展望

目前对于线粒体内黏度、极性等微环境参数检测的荧光探针虽有报道，但是灵敏度不足限制了它的发展，成为生物医学研究和诊断治疗中的薄弱领域，所以提高探针检测灵敏度将是研究的热点之一。另一方面，把药物通过二硫键等特殊基团连接到探针上，利用探针的线粒体定位功能将药物携入到线粒体内部，达到药物定位释放的目的，也将是线粒体相关类荧光探针的研究热点。

References

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Foundation item: supported by the National Natural Science Foundation of China (21136002, 21422601, 21421005), the National Basic Research Program of China (2013CB733702), Ministry of Education (NCET-12-0080) and the Natural Science Foundation of Liaoning Province (2013020115).

Progress in research of mitochondrial fluorescence probes

JIANG Na1, 2, FAN Jiangli1, YANG Hongbao1, PENG Xiaojun1
(1State Key Laboratory of Fine Chemicals, Dalian University of Technology, Dalian 116024, Liaoning, China;2School of Chemistry and Chemical Engineering, University of Jinan, Jinan 250022, China)

Abstract：The researches on organelles are important ways to study the structure and function of cells. Mitochondria, the principal energy-producing compartments in most cells, play roles in the numerous vital cellular processes. Thus, the organelles are crucially involved in various pathologies. As one of the most important cellular organelles, mitochondria are always the focus of researches. There are three kinds of mitochondrial fluorescence probes. This paper mainly introduces and discusses the progresses of mitochondrial staining kind of fluorescent probes in recent 10 years on the basis of the fluorophore with positive charge or the introduction of positioning groups such as triphenylphosphine.

Key words：fluorescence; probe; mitochondria; cell biology; biotechnology; imaging

Corresponding author:Prof. PENG Xiaojun, pengxj@dlut.edu.cn

基金项目：国家自然科学基金项目（21136002，21422601，21421005）；国家重点基础研究发展计划项目（2013CB733702）；教育部新世纪优秀人才支持计划（NCET-12-0080）；辽宁省自然科学基金项目（2013020115）。

中图分类号：TQ 618.5

文献标志码：A

文章编号：0438—1157（2016）01—0176—15

DOI：10.11949/j.issn.0438-1157.20151007