DADS对Chk1/2基因高表达人胃癌MGC803细胞G2/M期的影响

夏　红，向姝霖,2,曾　颖，陆丽峰，刘　芳，凌　晖，苏　波，苏　琦

(1.湖南省胃癌研究中心南华大学肿瘤研究所， 湖南省高校肿瘤细胞与分子病理学重点实验室，湖南 衡阳　421001；2. 南华大学附属怀化医院，怀化市第一人民医院，湖南 怀化　418000)



DADS对Chk1/2基因高表达人胃癌MGC803细胞G2/M期的影响

夏红1，向姝霖1,2,曾颖1，陆丽峰1，刘芳1，凌晖1，苏波1，苏琦1

(1.湖南省胃癌研究中心南华大学肿瘤研究所， 湖南省高校肿瘤细胞与分子病理学重点实验室，湖南 衡阳421001；2. 南华大学附属怀化医院，怀化市第一人民医院，湖南 怀化418000)

中国图书分类号：R329.24；R329.28；R345.57；R735.202.2；R916.4；R979.1

摘要:目的在建立Chk1/2基因高表达人胃癌MGC803细胞基础上，探讨DADS对Chk1/2高表达MGC803细胞G2/M期的作用。方法分别采用集落形成实验、流式细胞术、RT-PCR、Western blot等方法，检测DADS对Chk1/2高表达MGC803细胞增殖、细胞周期分布、Chk1与Chk2 mRNA与蛋白、p-Chk1与p-Chk2及CDC25C与cyclinB1的表达。结果软琼脂集落形成实验显示，30 mg·L-1DADS作用Chk1与Chk2高表达MGC803细胞组集落形成率均明显低于对照组与空载体组(P<0.05)。流式细胞术显示，30 mg·L-1DADS作用12、24、36、48 h后，Chk1/MGC803细胞G2/M期分别为41.3%、57.4%、68.9%、42.9%，较MGC803细胞与Chk2/MGC803细胞明显增加(P<0.05)。而Chk2/MGC803细胞与MGC803细胞差异没有显著性(P>0.05)。RT-PCR显示，Chk1/MGC803与Chk2/MGC803细胞Chk1与Chk2 mRNA水平较对照组无明显变化；并且，Western blot显示，Chk1与Chk2总蛋白及p-Chk2的表达无明显改变，但p-Chk1呈时间依赖性上调，CDC25C与cyclinB1呈时间依赖性下调(P<0.05)。结论DADS可阻滞Chk1/MGC803细胞于G2/M期，与上调磷酸化Chk1和下调CDC25C与cyclinB1有关。

关键词：二烯丙基二硫；人胃癌细胞；G2/M期；Chk1/Chk2激酶；CDC25C；cyclinB1

二烯丙基二硫(diallyl disulfide，DADS)是大蒜中的脂溶性有效成分，可抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞分化与凋亡、阻滞细胞周期、抑制血管形成及侵袭等，是一种很有开发潜力的抗肿瘤药物[1]。我们已经证实，DADS抑制人胃癌细胞增殖和G2/M阻滞与激活p38、抑制ERK/AP-1、上调组蛋白乙酰化、p21 WAF1等有关[2-4]。但是，诱导G2/M阻滞的机制尚未完全阐明。G2/M期检查点失活在细胞癌变过程中起着重要的作用，Chk1和Chk2是G2/M期检查点的两个关键激酶，而Chk1是重要靶点[5]。本研究在构建Chk1/2基因高表达MGC803细胞的基础上[6]，进一步探讨DADS对Chk1/2高表达人胃癌细胞周期阻滞的作用及其机制。

1材料与方法

1.1细胞培养人胃癌MGC803细胞株由本实验室保存，置于含10%小牛血清的RPMI 1640培养基中，37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱内传代培养。取对数生长期的细胞用于实验。

1.2主要试剂DADS为Fluka公司产品。DADS与Tween 80以1 ∶2的比例充分溶解后，加入体积分数为0.90%的生理盐水稀释100倍，作为母液保存于-20℃冰箱中。RT-PCR逆转录试剂盒为Promega公司产品；BCA蛋白定量试剂盒为Pierce公司产品；Chk1、Chk2、CDC25C、cyclin B1与β-actin抗体及ECL发光检测试剂盒购自Santa Cruz公司；p-Chk1(Ser345)、p-Chk2(Thr68)抗体与Anti-rabbit IgG购自Cell Signaling Technology；新生牛血清购自杭州四季青生物工程公司。引物用Primer Premier 5.0软件设计，由上海生工公司合成。

1.3软琼脂集落形成实验用双蒸水制备15 g·L-1和9 g·L-1浓度的低熔点琼脂糖溶液，高温高压灭菌后维持于40℃水浴中；同时制备3×RPMI 1640培养基(含300 mol·L-1小牛血清)，保存于37℃温箱中，临用时1 ∶2混合琼脂糖与3×RPMI 1640培养液，调整细胞浓度使最终细胞接种为1 000个/孔，每组3个平行样本，2周后观察集落形成情况并计数集落数，计算集落形成率。集落形成率/%=(对照组克隆均数-实验组克隆均数)/对照组克隆均数×100%。

1.4流式细胞仪测定收集已处理好的细胞，1 000 r·min-1离心5 min，弃去培养液，5 mL PBS洗2次，离心，去PBS，加入70%乙醇固定24 h，流式细胞仪分析DNA含量，检测群体细胞中G1、S、G2/M期细胞百分率。

1.5RT-PCR分析Total RNA Kit提取细胞总RNA，在 AMV 酶作用下逆转录合成 cDNA。设计并合成PCR引物序列：Chk1：F 5′-CTGAAGAAGCA GTCGCAGTG-3′，R 5′-TTCCACAGGACCAAACATCA-3′，产物长度494 bp；Chk2：F 5′-TCCGCTTGCTGATGATCTTTATGG-3′，R 5′-GACCTACTCCTTGGGCTCG GCTAT-3′，产物长度498 bp；β-actin： F 5′-CGTCATA CTCCTGCTT-3′，R 5′-ATCTGGCACCACACCT-3′，产物长度820 bp。PCR反应条件：Chk1：95℃，5 min；30个PCR循环(95℃，30 s；53.5℃，30 s；72℃，60 s；72℃，5 min)。Chk2：95℃，5 min；30个PCR循环(95℃，30 s；60℃，15 s；72℃，60 s；72℃，5 min)。β-actin：94℃，5 min；30个PCR循环(94℃，30 s；62.7℃，30 s；72℃，60 s；72℃，5 min)。5 μL的PCR产物经1%的琼脂糖电泳，嗅化乙啶染色，通过IS1000图像分析软件读取目的条带灰度值，相对值以目的基因与β-actin灰度值之比表示。

1.6Western blot 分析分别收集细胞，冰PBS洗2次，以1×107个细胞浓度加入100~150 μL裂解液，冰上裂解1h，低温高速离心收集蛋白，以BCA蛋白定量测定法检测蛋白浓度。以每孔30μg的蛋白量加样，以5 ∶1倍体积与5×SDS加样缓冲液混合，100℃煮沸5 min变性，经10% SDS-PAGE凝胶电泳后，转移至硝酸纤维素膜上，用含5%脱脂牛奶的TBST(Tris-HCl 20 mmol·L-1，NaCl 137 mmol·L-1含0.1% Tween-20)封闭2 h，TBST洗膜3次，一抗37℃孵育2 h，TBST洗3次，每次15 min，相应的二抗孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min，化学发光剂检测蛋白质印迹，薄层扫描仪测定印迹区带的光密度值。

2结果

2.1软琼脂集落形成实验Tab 1显示，30 mg·L-1DADS作用后，Chk1与Chk2高表达MGC803细胞集落形成率均明显低于对照组与空载体组(P<0.05)。并且，Chk1较Chk2高表达细胞组明显降低(P<0.05)。对照组与空载体组差异无显著性。表明Chk1与Chk2高表达可抑制MGC803细胞增殖，而Chk1高表达更为明显。

2.2DADS对Chk1/2高表达的MGC803细胞周期影响Tab 2与Fig 1显示，30 mg·L-1DADS作用12、24、36、48 h后，Chk1/MGC803细胞G2/M期分别为41.3%、57.4%、68.9%、42.9%，较MGC803细胞与Chk2/MGC803明显增加(P<0.05)。而Chk2/MGC803细胞与MGC803细胞差异没有显著性(P>0.05)。表明DADS可阻滞Chk1/MGC803细胞于G2/M期与Chk1基因表达增加有关。

**P<0.05vsMGC803 and Chk2/MGC803

Fig 2　Total RNA in Chk1/2 MGC803 cells

A: Chk1/MGC803; B: Chk2/MGC803;1:0 h;2:12 h;3:24 h;4:36 h;5:48 h

Tab 1　The colony forming efficiency in MGC803 cells of overexpression of Chk1/2 gene

**P<0.05vsMGC803 and vector/MGC803;#P<0.05vsChk2/MGC803

Fig 3　Effects of DADS on Chk1/Chk2 mRNA expression in Chk1 or Chk2/MGC803 cells

A:Chk1/MGC803; B: Chk2/MGC803; M: Marker; 1: 0 h; 2: 12 h; 3: 24 h; 4: 36 h; 5: 48 h.

2.3DADS对Chk1/2高表达MGC803细胞Chk1与Chk2 mRNA的影响Fig 2凝胶电泳显示28S和18S条带浓而亮，总RNA纯度高，完全符合RT-PCR要求。Fig 3显示，30 mg·L-1DADS处理12、24、36、48 h后，Chk1/MGC803与Chk2/MGC803细胞Chk1与Chk2 mRNA表达与对照组差异无显著性(P>0.05)。

2.4DADS对Chk1/2高表达MGC803细胞Chk1/Chk2蛋白与磷酸化的影响Fig 4显示，30 mg·L-1DADS处理12、24、36、48 h后，Chk1与Chk2高表达MGC803细胞Chk1与Chk2总蛋白及p-Chk2表达分别较对照组无明显改变(P>0.05)。而Chk1/MGC803细胞p-Chk1呈时间依赖性表达上调(P<0.05)。

2.5DADS对Chk1高表达MGC803细胞CDC25C与cyclinB1表达的影响Fig 5显示，30 mg·L-1DADS处理12、24、36、48 h后，Chk1/MGC803细胞CDC25C与cyclinB1表达呈时间依赖性表达下调(P<0.05)。

3讨论

G1/S和G2/M期检查点失活在细胞癌变过程中起着重要的作用，靶向检查点已成为肿瘤治疗的新策略。研究显示，α-pinene通过上调Chk1与Chk2和下调cyclin B、CDC25与CDK1抑制肝癌细胞增殖[7]。Jaridonin 通过上调p-ATM，激活Chk1与Chk2导致CDC25C、Cdc2与H2A.X磷酸化，阻滞食管癌细胞G2/M。ATM抑制剂可逆转ATM与Chk1/2活化以及CDC25C、Cdc2与H2A.X 的磷酸化和G2/M 阻滞[8]。

Tab 2　Effects of DADS on G2/M arrest in

**P<0.05vsMGC803 and Chk2/MGC803

大量研究表明，Chk1是G2/M 阻滞的关键靶点。Selvarajah等[9]报道，沉默mTOR或采用mTORC1/2激酶抑制剂可防止etoposide 诱导G2/M阻滞，阻止Chk1磷酸化与下调Chk1，而不是Chk2,表明mTOR抑制剂可通过mTORC2-Chk1途径克服乳腺癌治疗的抵抗。mTOR抑制剂RAD001可增加口腔癌SCC4细胞放疗敏感性，并且与放疗结合可通过活化Chk1增加G2/M阻滞[10]。恶嗪衍生物ZGDHu-1通过上调Chk1和下调cyclin B1与CDC2诱导胰腺癌PANC-1细胞凋亡与G2/M阻滞[11]。ZGDHu1可上调Chk1、p53、p27、pcdc25c, pChk1与pp53和下调cyclin B1、CDC2与CDC25c阻滞白血病Kasumi1细胞于G2/M，而Chk1抑制剂CHIR-124可消除ZGDHu1诱导G2/M阻滞[12]。gossypin可通过活化Chk1引起CDC25C磷酸化，诱导恶性胶质瘤U251细胞G2/M阻滞[13]。Chk1抑制剂与沉默Chk1通过ATR-Chk1途径，而不是ATR-Chk2可废除热应激诱导Jurkat细胞凋亡与G2/M检查点活化[14]。氯雷他定可直接损伤DNA，活化Chk1从而促进G2/M阻滞，使细胞对辐射诱导DNA损害易感[15]。

Fig 4　Effect of DADS on expression of Chk1/2

A:Chk1/MGC803; B: Chk2/MGC803; 1:0 h;2:12 h;3:24 h;4:36 h; 5:48 h;*P<0.05vscontrol.

Fig 5　Effect of DADS on CDC25C and cyclinB1

**P<0.05vscontrol

我们先前证明，DADS可通过ATR/Chk1/CDC25C/cyclin B1通路，磷酸化ATR，激活Chkl，下调CDC25C 和cyclinB1，阻滞MGC803细胞G2/M[16-17]。DADS通过特异性磷酸化Chk1，而不是Chk2，抑制CDC25C/cyclin B1途径，阻滞人胃癌BGC823细胞于G2/M期。沉默Chk1可消除G2/M期阻滞和下调CDC25C与cyclin B1，但沉默Chk2作用不明显。提示沉默Chkl基因可消除DADS诱导BGC823细胞G2/M期阻滞[18]。然而，阐明DADS阻滞MGC803细胞G2/M阻滞的作用靶点是Chkl或Chk2，必须建立高表达Chkl/Chk2胃癌细胞证实。

本研究在建立Chk1/Chk2基因高表达MGC803细胞的基础上，进一步研究显示，DADS作用12、24、36、48 h后，Chk1/MGC803细胞G2/M期较MGC803细胞与Chk2/MGC803细胞明显增加(P<0.05)。但是，Chk1/MGC803细胞G2/M期较MGC803细胞没有明显差异。并且，Chk1、Chk2 mRNA与总蛋白和p-Chk2表达无明显变化，而Chk1/MGC803细胞p-Chk1上调和CDC25C与cyclin B1下调(P<0.05)。表明DADS通过Chk1/CDC25C/cyclin B1途径阻滞Chk1/MGC803细胞于G2/M期，进一步证实DADS阻滞人胃癌细胞G2/M阻滞的作用靶点是Chkl。

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Overexpression of Chk1/2 gene affects G2/M arrest in MGC803 cells induced by diallyl disulfide

XIA Hong1, XIANG Shu-lin1,2, ZENG Ying1, LU Li-feng1, LIU Fang1, LING Hui1, SU Bo1, SU Qi1

(1.CenterforGastricCancerResearchofHunanProvince,CancerResearchInstitute,KeyLaboratoryofCancerCellularandMolecularPathologyofHunanProvincialUniversity,UniversityofSouthChina,HengyangHunan

421001,China; 2.HuaihuaFirstHospitalAffiliatedtoUniversityofSouthChina,HuaihuaHunan418000,China)

Abstract:AimTo investigate the effects of diallyl disulfide(DADS) on G2/M arrest in Chk1/MGC803 and Chk2/MGC803 cells so as to establish stable human gastric cancer MGC803 cells with overexpression of Chk1/2 gene.MethodsThe colony formation, flow cytometry, RT-PCR and Western blot were used to detect the proliferation, cell cycle, and expression of Chk1/2 mRNA and protein, p-Chk1/2, CDC25C and cyclinB1, respectively.ResultsThe colony formation showed that the colony forming efficiency in Chk1/MGC803 and Chk2/MGC803 cells treated by 30 mg·L-1DADS was lower than in control group and vector group(P<0.05). Flow cytometry demonstrated that 41.3%, 57.4%, 68.9% and 42.9% of G2/M cells in Chk1/MGC803 were increased than in MGC803 and Chk2/MGC803, respectively after treated by DADS in 12,24, 36 and 48 h(P<0.05). At the same time, RT-PCR disclosed that expression of Chk1 and Chk2 mRNA had no marked change. Western blot showed that total proteins of Chk1 and Chk2 and p-Chk2 had invisible change, but expression of p-Chk1 was up-regulated, and CDC25C and cyclinB1 were down-regulated time-dependently in Chk1/MGC803 cells (P<0.05).ConclusionDADS arrests MGC803 cells at G2/M by increasing p-Chk1 expression to cause down-regulation of CDC25C and cyclinB1 simultaneously.

Key words:diallyl disulfide; gastric cancer cell; G2/M; Chk1/2 gene; CDC25C; cyclinB1

文献标志码：A

文章编号：1001-1978(2016)02-0199-06

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.02.011

作者简介：夏红(1976-)，女，博士生，实验师，研究方向：胃癌防治的分子机制，E-mail: 6970842@qq.com；向姝霖(1979-)，女，硕士，主治医师，研究方向：抗肿瘤药物分子机制，并列第一作者，E-mail: 15074566777@163.com;苏琦(1945-)，男，教授，博士生导师，研究方向：胃癌发生及防治的分子机制,通讯作者,E-mail: suqi1945@163.com

基金项目：国家自然科学基金资助项目(No 81102854, 81374013)；湖南省卫生厅科研课题(No B2015-182)

收稿日期:2015-11-08,修回日期:2015-12-11

网络出版时间：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160125.1557.022.html网络出版地址：2016-1-25 15:57