利用EMS进行茄子种质资源创新

肖熙鸥 林文秋 李威 刘国强 张晓虹 吕玲玲

摘要：【目的】利用EMS诱变进行茄子种质资源创新，为茄子新品种选育及其相关基因功能研究提供良好材料。【方法】在25 ℃下利用不同浓度（0、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%）的EMS溶液诱变处理茄子种子，筛选出适宜的EMS诱变浓度；然后以适宜浓度的EMS诱变液处理茄子种子，经过催芽后播种、定植，在植株的整个生育期进行相关性状调查。【结果】以1.0% EMS诱变处理18 h后，茄子种子的发芽率可达80%，适宜构建茄子突变体库。20 g茄子种子经1.0% EMS诱变处理18 h后催芽播种，最终获得984份M1代突变材料，且这些突变材料在长势、叶片形状、叶片颜色、分枝数、果实长度、果实颜色及雄性不育等方面表现出丰富的变异。【结论】经EMS诱变处理获得的M1代茄子表现出丰富的变异，可为其新品种选育及基因功能研究提供良好材料。

关键词： 茄子；EMS诱变；种质资源；性状突变；创新

中图分类号： S641.1 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）08-1247-07

Abstract：【Objective】In order to provide fine resources for breeding of new eggplant variety and research of its gene function， the germplasm resources of eggplant were innovated by EMS mutagenesis. 【Method】Under 25 ℃ condition， the eggplant seeds was mutagenized by different concentrations of EMS（0%， 0.5%， 1.0%， 1.5% and 2.0%）， respectively， so as to select optimal EMS concentration. Then the eggplant seed was mutagenized by EMS. After accelerating germination， the seedlings were transplanted to field. The mutant traits were investigated during growth period. 【Result】After being mutagenized by 1.0% EMS for 18 h， the seed germination rate was 80%， which indicated that 1% EMS was suitable for construction of EMS mutants library. A total of 984 M1 generation mutants were gained after 20 g eggplant seeds was mutagenized by 1.0% EMS. There were remarkable variations in plant growth， leaf shape， leaf color， fruit length， fruit color， fruit-bearing character and male sterile of these mutants. 【Conclusion】The M1 generation eggplant gained by EMS mutagenesis is suitable for eggplant variety breeding and gene function research because it shows abundant variations.

Key words： eggplant； EMS mutation； germplasm resource； trait mutation； innovation

0 引言

【研究意義】茄子（Solanum melongena L.）原产于印度，其栽培种的遗传背景相对狭窄（肖熙鸥等，2012；冯英娜等，2014），且由于不同地区间的种质资源不断交流，导致茄子种质同质化严重，遗传多样性减少（廖毅等，2009）。随着茄子基因组测序的完成（Hirakawa et al.，2014），茄子的研究逐步进入后基因组时代。与图位克隆相比，以突变体库为基础，利用基因组重测序技术定位基因具有快速、准确等特点（Just et al.，2013；Nordstr■m et al.，2013；Thole and Strader，2015）。此外，利用TILLING（Targeting induced local lesions in genomes）反向筛选突变体，也是目前研究基因功能最有效的手段之一（McCallum et al.，2000；石从广等，2010）。因此，加强茄子种质资源创新，扩展其遗传基础对茄子新品种选育具有重要意义。【前人研究进展】通过化学、物理、生物及航空诱导等手段能够显著提高植物的诱变率（徐明和路铁刚，2011），如邱正高等（2009）利用航空诱变，获得了玉米矮杆突变体；Saito等（2011）利用Co60照射诱变番茄获得了丰富的突变体，成功构建了番茄的突变体库。甲基磺酸乙酯（Ethylmethylsulfone，EMS）是最常用的诱变剂，因具有诱变效率高且不易造成染色体畸变的优点而被广泛用于构建突变体库。在种质创新方面，已在油菜（石从广等，2010；张凤启等，2010）、水稻（邱福林，2007；Takagi et al.，2013）、小麦（徐艳花等，2010；Zhang et al.，2015）等作物上应用EMS诱变成功构建了突变体库，这些突变体为种质资源创新和新品种选育提供了良好的材料。在基础研究方面，已利用EMS突变体克隆获得多个与植物重要农艺性状相关的基因，如Takagi等（2013）利用水稻突变体克隆了水稻耐盐基因（hst），Zhou等（2015）利用黄瓜突变体克隆了控制果色的ARC5基因。可见，EMS突变体为基因资源的利用及辅助育种奠定了良好基础（Abe et al.，2011；Takagi et al.，2013，2015）。【本研究切入点】目前，茄子种质资源的创新主要是利用常规杂交、远缘杂交等（曹必好等，2009；王益奎等，2015），而利用EMS诱导进行茄子种质创新的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】以稳定遗传的茄子自交系为材料，探究不同EMS浓度对茄子发芽率的影响，建立茄子EMS诱变体系，并利用建立的体系诱变茄子种子进行种质资源创新，以期为茄子新品种选育和基因功能研究提供良好的材料。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

以遗传稳定的自交系E31-1为试验材料，其果实呈棒状，果皮紫色，果长约35 cm，花冠紫色，高抗青枯病。选取颗粒饱满、无病变的种子进行EMS诱变。EMS（产品号M880-5g）购自美国Sigma公司。

1. 2 诱变体系建立

利用磷酸钾缓冲液（pH 7.2）配制不同浓度的EMS诱变液（0、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%），将100粒茄子种子置于10 mL EMS诱变液中，25 ℃下摇床（100 r/min）处理18 h后，利用5%硫代硫酸钠终止反应，清水冲洗3～4次，洗净种子表面上的残留物。然后28 ℃下催芽，统计发芽率，20 d后仍未发芽的种子视为不发芽。

1. 3 诱变体库构建

利用1.0% EMS诱变液按上述方法处理20 g茄子种子，将催芽的茄子种子播种于50孔穴盘中育苗，1个月后移栽于中国热带农业科学院南亚热带作物研究所蔬菜课题组基地，按照常规管理技术进行栽培管理。田间调查参考李锡香和朱德蔚（2000）的《茄子种质资源描述规范和数据标准》，苗期性状包括子叶颜色、叶片色、第一片真叶形状等，开花期性状包括花瓣颜色、花瓣数目、花瓣形态、花冠大小、花序形态、柱头外露、育性等，成熟期性状包括株高、分支数、果实大小、果实颜色、坐果数等。

2 结果与分析

2. 1 EMS诱变对茄子种子发芽率的影响

EMS诱变效果受其浓度、处理时间、处理温度等外界条件的影响。为了平衡突变率与致死率间的关系，需确定适宜的EMS诱变浓度。由图1可知，随着EMS浓度的升高，种子发芽率快速下降，当诱变浓度达2.0%时几乎不萌发。EMS诱变浓度影响种子发芽率的同时，也影响种子的发芽势。在本研究中，使用磷酸缓冲液处理的茄子种子（对照组）在催芽后5 d开始萌发，至第10 d时基本萌发完全（发芽率98%），而经1.0% EMS诱变处理后，茄子种子在第10 d开始萌发（图2），至第16 d时才基本萌发完全，发芽率为80%。因此，选择1.0% EMS进行茄子种质资源创新。

2. 2 苗期性状调查结果

20 g茄子种子经1.0% EMS诱变处理18 h后催芽播种，最终得到2135株幼苗。苗期调查结果显示，茄子幼苗的子叶大小、颜色等表现出丰富的变异性（图3）。其中，95.32%植株的第一片真叶表现出突变，但第二片真叶恢复正常。

2. 3 植株长势调查结果

定植的2135株幼苗受台风危害后仅剩余984份材料，其性状表现出丰富的变异。984株M1代茄子的长势在整体上极不均匀，与对照组相比，总体长势相对较弱，其中有11%的植株长势受到严重抑制。此外，有35株M1代茄子表现为植株退化且花器形成较晚，1株M1代茄子表现为节间短缩。

2. 4 叶片性状调查结果

M1代群体的叶片大小、颜色形状均已发生丰富变异（表1，图4），共有3株植株叶片表现出黄化现象，且均为嵌合体。其中，1株植株的一半叶片发生黄化（图5-A），1株仅有两片叶片部分黄化（图5-B），1株的整体黄化程度较轻，仅表现为新生叶片呈黄绿色（图5-C）。在叶片大小变异方面，叶片退化突变体的频率最高（3.56%）（图4-B），其次为叶片变小（2.13%）（图4-C），仅1.12%的叶片变大（图4-D）。除了叶片黄化外，有13株植株的叶片紫色加深（图4-E），同时存在叶缘（图4-F）和叶尖（图4-G）等形状发生变异。

2. 5 果实性状调查结果

野生型茄子果实长约35 cm，紫色，棒状，果顶圆。M1代群体在果实的大小、长度、颜色和形状等方面均表现出丰富的变异（表2），共有70株表现出明显的变异，突变频率为7.11%。其中，果實性状变异频率最高的为果实变粗（图6-A），其次为果实变短（图6-B），有22株M1代茄子的果实同时变短变粗。4株M1代茄子果实明显变长（图6-C和图6-D），达37～47 cm；6株M1代茄子材料表现出两个果实并生畸形（图6-E）。在果实颜色的突变体中，有2株M1代茄子果实呈深黑色，色泽光亮（图6-F）。3株M1代茄子资源果顶变尖（图6-G）。果实是茄子的商品器官，其形状、色泽对商品性有着重要意义，同时果实的长度、粗度是构成产量的主要因素，M1代群体中果实性状的有利突变体可作为品种改良的基础材料。

2. 6 茎杆性状调查结果

由于EMS对植物生长具有抑制作用，因此未进行植株的株高、株幅调查，而仅针对其分枝情况进行调查。野生型植株第1次分枝在距离地面35～40 cm，而在M1代中有160株植株的第1分枝节位变矮，主要分布在10～20 cm（图7-A）。除了分枝节位变矮外，分枝数量也出现变异，有7株M1代茄子出现3个分枝（图7-B），有2株表现为4个分枝。分枝节位的变低及分枝数增加，有利于茄子早熟和增产。

2. 7 花器性状调查结果

花器的变异最少，在调查的984株突变体中仅发现2株雄性不育材料。初步形态观察推断，1株表现为雄蕊退化，另外一株表现为花粉败育，其不育机理有待进一步探究。此外，1株植株中的侧枝花朵变白，萼片变绿；1株植株与其他突变体相比，约提早开花7 d。

2. 8 坐果性状调查结果

野生型植株主要为单个坐果，而在突变体中出现集中坐果的突变株。集中坐果的突变植株主要表现为三大类：一是分枝多，每个分枝同时坐果（图8-A）；二是坐果的节位集中，一个节位一个果，茄子坐果集中（图8-B）；三是同一节位坐2～3个果实（图8-C）。

3 讨论

突变体的构建需要解决两个问题；一是产生足够的突变，二是突变能够遗传给后代。EMS诱变浓度、处理时间是影响其诱变效果的主要因素。张凤启等（2010）认为0.4% EMS处理12 h对甘蓝型油菜的诱变效果最佳；李文慧（2014）利用0.8% EMS处理番茄24 h后成功获得含有丰富突变性状的突变体库。在本研究中，以1.0% EMS处理18 h后的种子发芽率为80%，可能是由于茄子种子相对较大、种皮较厚，因此需要较高浓度的EMS诱变才能产生丰富的突变体。经EMS诱导处理后，茄子不同生理表观性状发生突变的频率也不同，在984份M1代植株中，有160株M1代茄子的第1分枝节位变矮，变异频率最高，而花器的变异频率最低，仅有4株植株表现出变异。但在甘蓝型油菜中，花器性状的突变类型丰富，突变频率最高（孙加焱等，2007；张凤启等，2010）。这可能是由于高突变率的性状受多个基因调控，突变频率低的性状仅受少数基因调控。

EMS誘变产生的M1代隐性突变较多，少量为显性突变，即大多数突变性状在M1代不会表现，但在M2代会表现出突变性状，因此当前利用MutMap技术克隆控制重要农艺性状及TILLING技术反向筛选突变时主要是利用M2代群体（Aba et al.，2011；Kurowska et al.，2011）。本研究仅调查了M1代群体的相关性状，因此需对M1代进行单株留种，在M2代进行重点考察。以EMS进行诱变不仅能开展种质创新和基因功能研究，利用突变体与常规育种手段相结合还能加速品种选育的进程（Takagi et al.，2015）。本研究中使用的材料为茄子高代自交系，遗传稳定，综合性状优良，具有潜在的利用价值，对其诱变体进行自交2～3代可获得表现优良的株系（纯合体），既可作为杂交育种的亲本，又能作为常规种直接用于生产，进而缩短育种年限。

4 结论

经EMS诱变处理获得的M1代茄子表现出丰富的变异，可为其新品种选育及基因功能研究提供良好材料。

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（責任编辑 兰宗宝）