艾纳香遗传多样性的SRAP和AFLP对比分析

张影波 袁媛 庞玉新 王丹 胡璇

摘要：【目的】分析艾纳香的遗传多样性，为制定其保护策略提供参考依据。【方法】使用分子标记中常用的SRAP和AFLP分子标记对35份艾纳香资源的遗传多样性进行对比分析与评估。【结果】8对AFLP引物组合和27对SRAP引物组合分别扩增获得1360条AFLP多样性条带（多样性比率为99.48%）和265条SRAP多样性条带（多样性比率为97.78%）；SRAP分子标记的有效信息位点指数（PIC）、有效多样性指数（EMR）和标记指数（MI）分别为0.4381、8.1000和4.3141，AFLP分子标记的PIC、EMR和MI分别为0.1773、198.0000和301.1348；基于AFLP多样性条带和SRAP多样性条带的遗传相似度对比分析结果表明，35份艾纳香样品的遗传相似度为0.4450～0.9179，两种分子标记的相关系数r=0.47；基于SRAP分子标记遗传相似系数，35份艾纳香样品可分为五大类群；而基于AELP分子标记遗传相似系数，35份艾纳香样品可分为四大类群。【结论】AFLP和SRAP分子标记均可用于艾纳香的遗传多样性分析，但AFLP分子标记分析的多样性位点多、分子标记特征指数高，更适合用于艾纳香的遗传多样性研究。

关键词： 艾纳香；遗传多样性；AFLP；SRAP；对比分析

中图分类号： S567.23 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）08-1261-07

Abstract：【Objective】The genetic diversity of Blumea balsamifera D C. was estimated， in order to provide reference basis for its protection strategy. 【Method】Based on AFLP and SRAP molecular markers， the genetic diversity of 35 B. balsamifera accessions was estimated. 【Result】A total of 1360 AFLP polymorphism bands（polymorphic ratio of 99.48%） and 265 SRAP polymorphism bands（polymorphic ratio of 97.78%） were amplified using 8 AFLP primer combinations and 27 SRAP primer combinations. Polymorphism information content（PIC）， effective multiplex ratio（EMR） and marker index（MI） of SRAP molecular marker were 0.4381， 8.1000 and 4.3141， respectively. PIC， EMR and MI of AFLP molecular marker were 0.1773， 198.0000 and 301.1348， respectively. Based on AFLP and SRAP polymorphic bands， the genetic similarity of 35 accessions ranged from 0.4450 to 0.9179， and the correlation coefficient（r） was 0.47. The UPGMA clustering results showed that， based on genetic similarity coefficient of SRAP molecular marker， 35 accessions could be classified into 5 clusters， but based on genetic similarity coefficient of AFLP molecular marker， 35 accessions could be classified into 4 clusters. 【Conclusion】Both SRAP and AFLP molecular markers can used to estimate genetic diversity of B. balsamifera， but AFLP molecular marker is more suitable to estimate genetic diversity of B. balsamifera because it has more polymorphic sites and higher marker characteristic index.

Key words： Blumea balsamifera D C.； genetic diversity； AFLP； SRAP； comparative analysis

0 引言

【研究意義】艾纳香（Blumea balsamifera D C.）为多年生木质草本植物，主产于我国和东南亚国家，在我国分布在东经97°30′～121°55′、北纬21°30′～25°50′，包括贵州、广西、广东、云南、福建和台湾等省（区）的热带雨林边缘或河床谷地，偶见散生于林间草地上，是海南、贵州、广西等地黎族、苗族、壮族等少数民族的重要中药，其艾片、艾粉和艾纳香油是重要的医药工业原料（Pang et al.，2014）。随着工业园区的扩大发展和城市化进程的加快，艾纳香的栖息地急剧减少，遗传多样性急剧降低。分子标记是评估植物遗传多样性的重要手段及方法。因此，利用分子标记技术分析艾纳香的遗传多样性，对高效评估艾纳香遗传多样性指数及制定艾纳香遗传多样性保护策略具有重要意义。【前人研究进展】RAPD、ISSR、SRAP、AFLP和SSR等分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的理想遗传标记技术，已广泛应用于大血藤（廖文波等，1999）、金毛狗（伍莲，2005）、罗汉果（周俊亚，2005；彭云滔，2006）、天麻（关萍等，2007）等药用植物及野生植物的遗传图谱构建、种质资源鉴定、基因定位、遗传多样性分析及基因克隆等。国内外学者曾尝试利用AFLP、RAPD等分子标记技术研究艾纳香的亲缘关系及遗传多样性，如Pornpongrungrueng等（2007）利用ITS序列分析了艾纳香属植物的亲缘关系，庞玉新等（2010）利用RAPD分子标记技术分析了4个艾纳香种群的克隆多样性和遗传多样性。此外，黄永林等（2010）、王远辉等（2012）和严启新等（2012）对艾纳香的化学成分进行了分析。【本研究切入点】目前，国内关于分子标记技术在艾纳香遗传多样性分析中应用的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】采用分子标记中常用的SRAP和AFLP分子标记，对35份艾纳香资源的遗传多样性进行对比分析，探索分子标记用于艾纳香遗传多样性分析的有效性，为艾纳香遗传多样性评估及制定艾纳香遗传多样性保护策略提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

根据文献调查和对馆藏艾纳香标本的考证，在海南、云南、贵州、广东、广西及福建等地采样，并选取35份典型的艾纳香材料进行遗传多样性分析，其来源地及地理信息见表1。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 DNA提取 参照德国QIAGEN DNeasy植物微量提取试剂盒使用说明，对35份艾纳香样品的基因组DNA进行提取，然后依据其紫外吸光值（A260）将样品DNA稀释至30 ng/μL。

1. 2. 2 AFLP扩增与分析 参照美国GIBCO-BRL公司AFLP试剂盒操作说明对8对AFLP（PstI/MseI）扩增引物组合（表2）进行选择性扩增，其数据结果使用该公司配套的SAGA MX软件进行统计，并按照软件的操作说明分别标记泳道和Maker，获取0/1标记，然后将所有样品的0/1条带转化成数据矩阵。

1. 2. 3 SRAP扩增与分析 参照Li和Quiros（2001）的方法进行SRAP扩增，所选引物见表3。电泳后用Gel Doc XR+（Bio-Rad公司）凝胶成像系统进行拍照分析，用Cross Checker 5.0打开胶图，并按照软件的操作说明分别标记泳道和Maker，获取0/1标记，然后将所有样品的0/1条带转化成数据矩阵。

1. 3 统计分析

1. 3. 1 引物特征信息统计 参照Roldán-Ruiz等（2000）的方法，对SRAP和AFLP的标记特征[多样性条带（Polymorphic band）、唯一条带（Monomorphic band）、稀有条带（Unique band）、近似条带（Similar band）、共有条带（Shared band）、多样性条带比率（Polymorphic ratio）、有效信息位点指数（Mean polymorphism information content，PIC）、有效多样性指数（Mean effective multiplex ratio，EMR）和標记指数（Mean marker index，MI）进行统计。其中，PIC参照Roldan-Ruiz等（2000）的方法进行计算，MI参照Varshney等（2007）的方法进行计算。

1. 3. 2 聚类树图生成 基于SRAP和AFLP引物的0/1数据矩阵，利用NTSYSpc-2.11F中的SimQual程序求各个体间的DICE相似系数，然后利用SHAN程序中的UPGMA方法进行聚类分析，并通过Tree plot模块生成聚类图，计算相关系数。

2 结果与分析

2. 1 引物特征信息统计结果

由表4可知，艾纳香27对SRAP引物组合共扩增获得271条条带，其中265条为多样性条带（变异范围5～16条），多样性条带比率为97.78%，唯一条带、稀有条带、近似条带和共有条带分别为18、22、109和116条，PIC、NMR和MI分别为0.4381、8.1000和4.3141。8对AFLP扩增引物组合共扩增获得1367条条带，其中1360条为多样性条带（变异范围123～198条），多样性条带比率为99.48%，唯一条带、稀有条带、近似条带和共有条带分别为264、423、556和117条，PIC、EMR和MI分别为0.1773、198.0000和301.1348。说明8对AFLP扩增引物组合比27对SRAP扩增引物组合扩增获得了更多的遗传多样性条带。综上所述，与SRAP分子标记相比，AFLP分子标记具有更高的标记指数，更适合用于艾纳香的遗传多样性评估与分析。

2. 2 聚类分析结果

通过NTSYSpc-2.11F中的SimQual程序对35份艾纳香样品间的Jaccards相似系数进行计算，获得35份艾纳香样品间的相似系数为0.4450～0.9179，其中基于265条SRAP多样性条带间的遗传相似系数为0.4450～ 0.9179（图1），基于1360条AFLP多样性条带间的遗传相似系数为0.6651～0.9020（图2）。基于AFLP分子标记和SRAP分子标记的相关系数分析结果表明，两种分子标记的遗传相关性r=0.47，表明AFLP分子标记与SRAP分子标记呈现一定的相关性。

利用SHAN程序中的UPGMA方法对35份样品进行聚类分析。基于SRAP分子标记（图1），当遗传相似度为0.6000时，35份样品可分为五大类群。类群I包括3份贵州的样品，样品编号分别为GZ1、GZ2和GZ3，遗传相似度为0.8454～0.8707。类群II包括18份样品，涵盖了研究样品数目的50%以上，遗传相似度为0.6972～0.9179，其内又可分为3个亚类群，亚类群1包括8份来源于贵州的样品，样品编号分别为GZ4～GZ11，样品间的平均相似系数为0.8549；亚类群2包括5份来源于广西的样品，样品编号分别为GX1～GX5，样品间的平均相似系数为0.8864；亚类群3包括5份来源于云南的样品，样品编号分别为YN1～YN5，样品间的平均相似系数为0.7918～0.8864。类群III包括7份海南的样品，样品编号为HN6～HN12，遗传相似度为0.6486～ 0.8170。类群IV包括5份海南的样品，样品编号为HN1～HN5，遗传相似度为0.6909～0.8454。类群V包括两份广东的样品，样品编号为GD1和GD2，遗传相似度较低，为0.4450，推测来源于广东的样品可能有独特的起源或与广东独特的地理位置有关。

基于AFLP分子标记（图2），当遗传距离为0.6947时，35份样品可分为四大类群。类群I涵盖了超过80%的样品，其内又可分为4个亚类群，其中亚类群1包括海南的12份样品、贵州的6份样品、广西的4份样品和云南的2份样品，遗传相似度为0.7835～0.9020；亚类群2包括1份来源于贵州的样品，样品编号为GZ4；亚类群3包括3份来源于贵州的样品，样品编号分别为GZ1、GZ10和GZ11；亚类群4包括3份样品，分别为来源于广东的GD1、GD2和来源于贵州的GZ9。类群II、III和IV均包括单独的一个样品类群，分别为YN3、GZ8和YN4。与SRAP分子标记聚类分析结果相比，AFLP分子标记分析的结果显示35份艾纳香遗传资源具有更高的多样性，其聚类分析结果与地理位置的相关性较小，不同来源的样本常被分为多个类群，推测与AFLP分子标记的灵敏度高有关。

3 讨论

RAPD、ISSR、AFLP、SRAP及SSR等分子标记已广泛应用于植物的遗传多样性和遗传分化研究（考安都等，2014；孙建等，2014；杨海健等，2014；张安世等，2014；林乐静等，2015；周娜等，2015），但适用研究目的存在差异（Chowdhury et al.，2002；Maguire et al.，2002）。如RAPD和ISSR分子标记因采用随机引物，检测范围遍及整个基因组，同时具备简便、快速、花费低及高效性等优点，因而适用于基因组DNA多态性检测、种质资源分类及鉴定等研究（Huang and Sun，2000）；SSR分子标记具有数量丰富、多态性信息量高、检测结果准确可靠、重复性强、操作简便快速，且对DNA数量及质量要求不高等特点，已广泛应用于遗传图谱构建、比较基因组研究、遗传多样性分析和种质鉴定等方面（Budak et al.，2004）；AFLP分子标记具有多态水平高、检测位点最多、操作简便、分辨率高、速度快及DNA用量少等优点，适用于遗传图谱构建、种质资源鉴定、基因定位、遗传多样性分析（Maguire et al.，2002；Budak et al.，2004）；SRAP分子标记是新发展起来的分子标记技术，是利用基因序列外显子中G、C含量丰富及启动子和内含子中A、T含量丰富的特点设计两套引物，对开放阅读框架进行扩增，该技术集中了RAPD、SSR和AFLP等分子标记技术的优点，具有共显性、简便、稳定、操作简单、重复性强及中等产率的特点，在基因组中分布均匀，适合对不同作物进行基因定位、基因克隆和遗传图谱构建（Li and Quiros，2001；Chowdhury et al.，2002；Maguire et al.，2002）。本研究中使用PIC、EMR和MI等分子标记特征指数对SRAP和AFLP分子标记特征进行对比分析，发现SRAP的分子标记特征指数分別为0.4381、8.1000和4.3141，AFLP的分子标记特征指数分别为0.1773、198.0000和301.1348，对其进行遗传相似性和聚类分析亦发现，SRAP与AFLP两种分子标记的相关系数r=0.47，表明这两种分子标记方法均适用于对艾纳香进行遗传多样性研究，但AFLP具有多样性位点多、分子标记指数高等优点，更适合于艾纳香的遗传多样性评估。

当两种或两种以上分子标记用于同一研究对象时，可能产生差异性结果。如Budak等（2004）使用ISSR、SSR、RAPD和SRAP 4种分子标记开展野牛草遗传多样性研究时，发现RAPD与ISSR分子标记的相关系数仅0.010；而Ravi等（2003）使用RAPD和SSR分子标记研究水稻的遗传多样性时，发现其矩阵的相关系数为0.582；Patzak（2001）、Belaj等（2003）、Garcia等（2004）及Scariot等（2007）的研究也获得了相似的结果。本研究发现，35份艾纳香样品的遗传相似度为0.4450～0.9179，其遗传距离与地理的遗传距离呈现一定的相关性，两种分子标记的相关系数r=0.47，也呈现一定的相关性。

4 结论

AFLP和SRAP分子标记均可用于艾纳香的遗传多样性分析，但AFLP分子标记具有多样性位点多、分子标记特征指数高等优点，更适合艾纳香的遗传多样性研究。

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（責任编辑 思利华）