小麦黏型核质互作雄性不育—恢复近等基因系的构建及其遗传背景检测

牛娜 马守才 王军卫 宋瑜龙 张改生

摘要：【目的】构建小麦黏型核质互作雄性不育—恢复近等基因系，为进一步探索小麦雄性不育机理及对不育及恢复基因的精细定位和图位克隆提供参考。【方法】利用黏型小麦雄性不育系Ms（Kost）-5-1为母本与恢复系RK5451杂交获得F1代，以Ms（Kost）-5-1为轮回亲本与F1代及回交后代中的可育株连续回交6～7代构建黏型小麦核质互作雄性不育—恢复近等基因系；利用SSR标记、醇溶蛋白的A-PAGE与田间农艺性状相结合的方法对所构建的近等基因系进行检测。【结果】定向快速获得16个小麦黏型核质互作雄性不育—恢复近等基因系（N2～N17）。SSR分子标记及A-PAGE检测结果表明，各近等基因系遗传背景与恢复系RK5451的差异较明显，而与不育系Ms（Kost）-5-1遗传背景趋近相同，N4、N10、N11和N16保留了较好育性恢复性。农艺性状差异及聚类分析结果表明，各近等基因系仅在株高上呈显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）差异，大多数农艺性状具有较高的相似性，N2、N3、N10、N16与不育系Ms（Kost）-5-1农艺性状差异最小。【结论】N10和N16为不育系Ms（Kost）-5-1较好的近等基因系，可用于进一步基因精细定位和图位克隆。

关键词： 小麦；雄性不育；近等基因系；恢复基因；分子标记

中图分类号： S512.1 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）08-1254-07

Abstract：【Objective】The present experiment was conducted to construct nucleo-cytoplasmic male sterility-restorer near-isogenic lines（NILs） of wheat with Ae. kotschyi cytoplasm， in order to provide reference for further researching mechanism of male sterile， mapping restorer gene and mapping-based cloning. 【Method】A male sterile line Ms（Kost）-5-1 was used as the recurrent parent to cross with restorer RK5451 and their F1， and backcross with fertile plants of their offspring for 6-7 generations to develop NILs of wheat with Ae. kotschyi cytoplasm. The SSR molecular markers， polyacrylamide gel electrophoresis（A-PAGE） methods combined with the agronomy traits were used to evaluate reliability of obtained NILs. 【Result】A total of 16 nucleo-cytoplasmic male sterility-restorer NILs（N2-N17） were obtained fast and accurately. The SSR molecular markers and A-PAGE showed that， the genetic background of all NILs were obviously different from restorer line RK5451， but extremely similar with sterile line Ms（Kost）-5-1. N4， N10， N11 and N16 retained ability to restore fertility. Furthermore， the agronomy traits difference and clustering analysis showed that， there were significant（P<0.05） or extremely significant difference（P<0.01） in plant height between every two NILs， and there was high genetic similarity in most of agronomic traits between every two NILs. However， the agronomic traits of N2， N3， N10 and N16 were the most different from sterile line Ms（Kost）-5-1. 【Conclusion】N10 and N16 are perfect NILs of restorer gene， and can be used to gene fine mapping and mapping-based cloning.

Key words： wheat； male sterile； near-isogenic line； restorer gene； molecular marker

0 引言

【研究意義】雄性不育广泛存在于生物界，主要表现为雌蕊发育正常，而雄花败育、无受精能力。自1951年首次报道小麦雄性不育以来，先后研究获得提莫菲维（Triticum timopheevi）细胞质的小麦提型雄性不育系和黏果山羊草（Aegilops kotschyi）细胞质的小麦黏型雄性不育系（Kihara，1951；Wilson and Ross，1962）。由于小麦提型雄性不育系具有不良的细胞质效应，如种子皱缩、发芽率低、穗易发芽等，且恢复源狭窄，群体优势较弱，不宜在生产中大面积推广应用（Kaul， 1988）；而小麦黏型雄性不育系易保持、易恢复，且无不良细胞质效应，具有良好应用前景（张改生等，1989， 1994，1996；牛娜等，2003）。因此，构建高质量的黏型雄性不育—恢复近等基因系（Near-isogonic line，NIL），开发其优良恢复基因，培育强恢复系，对探索小麦雄性不育、育性恢复机制及分子标记辅助育种均具有重要意义。【前人研究进展】近等基因系是经过连续回交获得的除控制目标性状基因不同而其他遗传背景均相同的一系列遗传材料（或品系）。近年来，随着分子标记技术的发展，现已广泛应用于近等基因系遗传背景的检测中（刘立科，2006；刘雅辉等，2008；徐美红等，2008；龙卫华等，2011；赵兴华等，2011），并成功构建了油菜、玉米、水稻、小麦、大豆等作物的近等基因系（王际凤和陆作楣，2008；李希锋和董娜，2012）。由于小麦雄性不育—恢复近等基因系的遗传背景极其相似，仅在育性上存在差异而日益受到关注，但成功构建近等基因系的报道较少。刘立科等（2006）构建了D2型小麦雄性不育近等基因系，并利用SSR分子标记对其遗传背景进行检测。许兰杰等（2009）构建了黏型小麦雄性不育近等基因系，通过调查农艺性状对其进行评价。郑宏远（2014）构建了以豫麦三号为遗传背景的黏型雄性不育系，并利用SSR标记对其遗传背景进行检测。【本研究切入点】RK5451是小麦黏型核质互作雄性不育系的一个优良恢复系（恢复度>90%），为了进一步研究其恢复基因，须构建其高质量的近等基因系，并进行遗传背景检测。但目前成功构建小麦雄性不育—恢复近等基因系的报道较少，且构建后仅单独利用农艺性状或分子标记进行评价，鲜见有农艺性状与分子标记及生化标记相结合对黏型小麦近等基因系的遗传背景进行检测的研究报道。【拟解决的关键问题】采用连续回交的方法，以小麦黏型雄性不育系Ms（Kost）-5-1为母本与恢复系RK5451杂交获得F1代，再以Ms（Kost）-5-1为轮回亲本与F1代及回交后代中的可育株连续回交6～7代，构建除育性差异外其他农艺性状均相似的小麦黏型雄性不育—恢复近等基因系，最后利用SSR标记、醇溶蛋白的A-PAGE与田间农艺性状相结合的方法对构建的近等基因系进行检测，为小麦雄性不育机理的研究、不育基因与恢复基因的精细定位和图位克隆打下重要基础，并促进小麦杂种优势利用三系途径的应用。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

小麦黏型核质互作雄性不育系Ms（Kost）-5-1、高恢复力的恢复系RK5451（测交恢复度在90%以上）由西北农林科技大学作物杂种优势研究与利用课题组保存提供。田间试验在西北农林科技大学试验田和国家小麦改良中心温室进行。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 近等基因系构建 利用系谱法与轮回选择相结合的方法（图1），以小麦黏型核质互作雄性不育系Ms（Kost）-5-1为母本与恢复系RK5451杂交得到F1代，再以不育系Ms（Kost）-5-1为轮回亲本与F1代回交。回交后代种植于试验田，在花发育的三核期，分别取回交后代植株的成熟花粉粒，用18%蔗糖+9% PEG- 4000+2 g/L Ca（NO3）2·4H2O+60 mg/L H3BO3的培養基置于28 ℃下培养50 min，计算花粉的萌发率，鉴定其育性，筛选出萌发率大于50%的单株为父本，与不育系Ms（Kost）-5-1回交，定向回交6～7代，获得小麦黏型核质互作雄性不育—恢复近等基因系。

1. 2. 2 近等基因系及亲本材料的育性恢复性检测 在小麦扬花期对不育系Ms（Kost）-5-1、恢复系RK5451及各近等基因系随机选取5株主茎穗套袋，于成熟期调查其自交结实率。

1. 2. 3 DNA提取与SSR分子标记检测 利用CTAB法提取近等基因系株系及亲本材料的基因组DNA，从GrainGenes网站（http：//wheat.pw.usda.gov/cgi-bin/grain-

genes/browse.cgi？class=marker）选取180对SSR引物，对2个亲本材料进行扩增，计算多态性比率。挑选出在亲本间均有多态性并位于1B染色体上的33对引物（表1）进行SSR扩增，扩增程序参照许兰杰等（2009），扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，对电泳结果进行统计分析。与不育系Ms（Kost）-5-1有相同条带的记为0，兼有不育系Ms（Kost）-5-1与恢复系RK5451记为1，遗传相似系数（GS）的计算参照申时全等（2004）的方法，计算公式为：

GS=■

式中，Ni为与不育系Ms（Kost）-5-1相同的条带数，Nj为与恢复系RK5451相同的条带数，Nij为2个材料共显性的条带数，利用SPSS 19.0进行统计分析，并根据统计结果进行聚类分析。

1. 2. 4 近等基因系醇溶蛋白的A-PAGE分析 取单粒种子在研钵中磨成粉末状，装入离心管，加提取液（0.05%甲基绿，25% 2-氯乙醇）。凝胶溶液含：10% Acr，0.5% Bis，6%尿素，0.005%硫酸亚铁，0.1%Vc，0.1% Gly，2%醋酸；采用改进的ISTA聚丙烯酰胺凝胶电泳（pH 3.2）标准程序进行分析（马守才等，2007）。

1. 2. 5 近等基因系的农艺性状调查 根据回交后代材料（BC6F1）的田间性状变异和育性基因情况，以不育系Ms（Kost）-5-1为对照，选取其中的近等基因系材料（编号N2～N17）进行调查。每个近等基因系株系均匀随机选取5株，测量其育性恢复性及其他农艺性状，包括小穗数、株高、穗长、穗脖长、旗叶长、旗叶宽、倒二叶长、倒一节长等，并进行聚类分析。

2 结果与分析

2. 1 近等基因系构建及其亲本材料的育性恢复性分析

将不育系Ms（Kost）-5-1与恢复系雄性RK5451经大田杂交和温室加代回交，成功获得16个雄性不育—恢复近等基因系（编号N2～N17）。由表2可知，各近等基因系已完全获得恢复系RK5451的恢复基因，在黏果山羊草背景下，各近等基因系具有较高的恢复力，但其恢复度仍存在一定程度的变异，最低的恢复度为70.9%，最高的为92.0%。各近等基因系除了育性与不育系Ms（Kost）-5-1截然不同外，其他遗传背景均相似，仍需进一步检测分析。

2. 2 近等基因系遗传背景的SSR检测与评价

选取180对SSR引物对2个亲本材料进行扩增，其中75对引物能扩增出2个亲本材料间多态性条带，多态性比率达41.7%。用这75对引物对2个亲本材料及近等基因系进行扩增，发现其中50对引物扩增产物在各近等基因系与恢复系RK5451间存在明显差异，但在各近等基因系材料与不育系Ms（Kost）-5-1间无明显差异（图2所示部分引物检测结果），表明构建的近等基因系其遗传背景与不育系已趋于一致。另外，在亲本间有多态性的75对引物中33对定位于1B染色体上，其余引物分布在其他染色体上，平均每条染色体上分布至少2对引物。由于育性恢复基因已被定位于1B染色体上，因此检测结果更能体现除育性等位基因差异外，1B染色体遗传背景的一致性。由表3可知，16个雄性不育—恢复近等基因系材料和不育系Ms（Kost）-5-1遗传相似度均高于78.0%，而与恢复系RK5451的遗传相似度均低于21.0%，表明通过与不育系Ms（Kost）-5-1多代回交，各近等基因系的遗传背景基本上与不育系趋于一致，而与恢复系PK5451的差别较明显。

聚类分析结果见图3，当欧氏距离为7.0时，供试材料被聚为五大类，第I类包括2个系，平均的遗传相似系数分别为84.9%；第II类包括5个系，其平均遗传相似系数为87.8%；第Ⅲ类包括4个系，平均遗传系数为90.8%；第Ⅳ类包括3个系，并与不育系Ms（Kost）-5-1归为一类，其平均遗传相似系数为94.3%；第V类包括2个系，其平均遗传系数最小为79.9%。综合分析发现N5、N6及N17与不育系Ms（Kost）-5-1具有较好的近等性，其遗传相似系数分别为0.9500、0.9400和0.9345，其次是第Ⅲ类N4、N10、N11和N16，虽然不与不育系Ms（Kost）-5-1聚为一类，但与其遗传相似系数均超过90.0%。上述结果与表1中育性恢复性相比较发现，聚类结果与育性恢复性的高低也具有很强的对应性，第I类育性恢复性主要集中在75.0%～80.0%，第II类主要集中在80.0%～85.0%，第Ⅲ类主要集中在85.0%～90.0%，第Ⅳ类主要集中在90.0%～95.0%，最低的是第V类育性恢复性集中在70.0%～75.0%。

综合分析SSR分子标记扩增结果，发现第Ⅲ类（包括N4、N10、N11和N16）不仅与不育系Ms（Kost）-5-1具有较高的遗传相似性，与其他类别相比，还具有最高的育性恢复性，表明这一类近等基因系在保留了较好育性恢复性的基础上，遗传基础又与轮回亲本不育系Ms（Kost）-5-1相似性极高，是较理想的近等基因系候选系。

2. 3 近等基因系醇溶蛋白谱带间的比较

基于SSR分析，以中国春两个重复（CS1、CS2）为对照，对第Ⅲ类群（N4、N10、N11和N16）及不育系Ms（Kost）-5-1、恢复系RK5451，进行醇溶蛋白A-PAGE分析，各设2个重复，共14个材料，电泳图谱结果如图4所示，每个材料均可分離出16～18条谱带，其中9条（约占50%）为14个供试材料的共有谱带，其他为供试材料的多态性谱带。经供试材料的谱带差异分析，发现共有5种带型，其中不育系Ms（Kost）-5-1和4个近等基因系带型基本一致，表明这4个供试近等基因系醇溶蛋白编码的基因位点与不育系一致，已达到纯合。

2. 4 各近等基因系与不育系Ms（Kost）-5-1农艺性状的差异及聚类分析

对近等基因系与不育系Ms（Kost）-5-1的农艺性状进行t 检验。由表4可知，各近等基因系与不育系Ms（Kost）-5-1相比，全部材料均在株高上呈显著（P<0.05）或极显著（P<0.01，下同）差异；N13在旗叶宽上呈极显著差异；N12、N15、N16和N17在穗脖长上呈极显著差异，N9、N13和N14在穗长上呈极显著差异。而其他性状如旗叶长、倒二叶长、倒一节长及小穗数等性状上与不育系Ms（Kost）-5-1并无显著差异（P>0.05）。

利用SPSS 19.0对构建的16个近等基因系和不育系Ms（Kost）-5-1农艺性状进行聚类分析，结果见图5。在欧氏距离12.0处，将17个材料聚为五大类，其中第Ⅳ组包括N2、N3、N10、N16等4个近等基因系和不育系Ms（Kost）-5-1，其旗叶宽、旗叶长、倒二叶长、穗脖长、倒一节长、穗长、小穗数等农艺性状与不育系Ms（Kost）-5-1基本一致，仅在株高上存在差异，表明16个近等基因系材料与轮回亲本的遗传背景非常相近。

与SSR分子标记聚类分析结果比较，不育系Ms（Kost）-5-1均被聚类到第Ⅳ组，然而其他近等基因系材料聚类结果完全不同。综合分析发现，在所有近等基因系中，基于SSR分子标记所划分的第Ⅲ类（包括N4、N10、N11和N16），是除第Ⅳ类外与不育系Ms（Kost）-5-1遗传距离最近的一组，在农艺性状聚类分析中，N10和N16又同时与不育系Ms（Kost）-5-1聚为一类，表明N10和N16的遗传背景与不育系Ms（Kost）-5-1较一致。

3 讨论

小麦雄性不育系及育性恢复近等基因系的构建对小麦雄性不育机理及育性恢复机制的探索具有重要意义。目前，有关小麦雄性不育恢复基因的研究主要集中在育性恢复基因定位，但对恢复基因进行微细定位和图位克隆尚存在一定难度，其原因是一定程度上受限于材料，而小麦雄性不育及恢复基因近等基因系的构建正好可解决材料问题。虽然小麦不同性状的近等基因系已成功构建（李希锋和董娜，2012），但针对小麦核质互作雄性不育系育性恢复系而言，成功构建近等基因系的报道较少。刘立科等（2006）以D2型细胞质雄性不育系MsD2-CA8057为受体，采用多代回交及定株（系）跟踪选择，成功培育成了D2型细胞质雄性不育系恢复基因的近等基因系。本研究以不育系Ms（Kost）-5-1为母本，以高恢复力恢复系RK5451为父本，采用特定回交程序能快速定向构建近等基因系。由于黏型小麦雄性不育系的恢复基因遗传属于配子体遗传（刘保申等，2000；詹克慧等，2006），因此，在构建近等基因系时应以不育系作为轮回亲本，与杂交及回交后代中的可育株进行连续回交可保证恢复基因不被丢失。

在近等基因系构建后，为保证所构建近等基因系的质量，应对其遗传背景进行检测，评价其质量的好坏。目前，对近等基因系的检测主要从两方面进行：一方面是利用形态标记对近等基因系的质量进行评价，另一方面是利用生化标记或分子标记对其检测。许兰杰等（2009）以17个小麦黏型不育系恢复基因的近等基因系和轮回亲本不育系豫麦3号为材料，通过调查农艺性状，对小麦黏型不育系恢复基因近等基因系的农艺性状进行差异比较和聚类分析，获得了黏型不育系的近等基因系。刘立科等（2006）利用SSR分子标记技术对构建的D2型小麦雄性不育近等基因系的近等性进行检测。本研究采用SSR分子标记与农艺性状相结合的手段检测近等基因系的遗传背景。SSR分子标记结果表明，第Ⅲ类（N4、N10、N11和N16）在保留了较好育性恢复性的基础上，遗传基础又与轮回亲本不育系Ms（Kost）-5-1相似性极高，是较理想的近等基因系候选系。农艺性状差异及聚类分析结果表明，第Ⅳ组包括N2、N3、N10、N16与不育系Ms（Kost）-5-1农艺性状差异最小。由于SSR分子标记结果与形态学标记存在一定差异，因此，综合形态分析和SSR分子标记才可获得较可靠的结果。综合分析认为N10和N16是最理想的近等基因系，可为恢复基因的精细定位和功能分析及基因克隆等研究工作打下基础。

4 结论

利用特定回交程序构建黏型小麦核质互作雄性不育—恢复近等基因系，利用SSR标记、A-PAGE醇溶蛋白分析与田间农艺性状相结合的方法对其遗传背景进行检测，发现N10和N16两个近等基因系为不育系Ms（Kost）-5-1的较好的近等基因系，可用于进一步基因精细定位和图位克隆。

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（责任编辑 陈 燕）