EGCG对水牛卵母细胞体外成熟的影响

李敏玲　陈富美　廖碧云　潘宏　黄德伦　黄凤玲　陆阳清　张明

摘要：【目的】探讨表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对水牛卵母细胞体外成熟质量与早期胚胎发育能力的影响，为优化水牛体外胚胎生产体系及提高其体外胚胎生产效率提供参考。【方法】在水牛卵母细胞体外成熟液中添加不同浓度的EGCG，以排出第一极体为细胞核成熟标志，观察卵母细胞核成熟情况，检测MII期卵母细胞内活性氧（ROS）和谷胱甘肽（GSH）含量，并统计经孤雌激活及体外受精后早期胚胎的发育情况。【结果】在体外成熟液中添加10～20 μmol/L EGCG有利于水牛卵母细胞体外成熟过程中卵丘扩展，卵丘扩展指数（CEI）分别为2.49%和2.42%，卵母细胞成熟率（59.31%和50.98%）显著高于未添加EGCG的CK组（P<0.05，下同），MII期卵母细胞的GSH含量（3.21和3.25 pmol/枚）也显著高于CK组；添加20～30 μmol/L EGCG可显著降低水牛MII期卵母细胞的ROS水平。以体外成熟培养获得的水牛MII期卵母细胞分别进行孤雌激活及体外受精，结果发现以在体外成熟液中添加10 μmol/L EGCG的效果最佳，其对应的卵裂率和囊胚发育率均显著高于CK组。【结论】EGCG可用于优化水牛卵母细胞体外成熟体系，能有效提高卵母细胞的成熟率和体外发育潜力，且以水牛体外成熟液中添加10 μmol/L EGCG的效果最佳。

关键词： 水牛；表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）；卵母细胞；体外成熟；胚胎发育

中图分类号： S823.83 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）03-0478-05

0 引言

【研究意义】目前，虽然卵母细胞体外成熟技术在科学研究、医学生殖方面取得了长足进展，但囊胚率较低、囊胚质量差、卵子得不到有效利用的问题依然存在，其原因可能是卵母细胞在体外氧化系统与抗氧化系统失衡，体外操作与环境因素致使卵母细胞不可避免地接触到更多的氧自由基，且得不到母体抗氧化剂的保护（彭中友等，2015）。因此，在卵母细胞体外成熟液中通常会添加外源抗氧化剂，以期有效解决上述问题。表没食子儿茶素没食子酸酯（Epi-gallocatechin-3-gallate，EGCG）提取自绿茶，其结构中含有多个酚羟基，是高效的植物源性抗氧化剂。已有研究证实，EGCG可提高机体抗氧化能力，显著降低机体过氧化物的生成（Devika and Stanely，2008），且能有效抑制Fe2+和H2O2诱发的脂质过氧化反应（李太坤，2012）。若将EGCG应用到卵母细胞体外成熟培养体系中，势必能促进胚胎工程的快速发展。【前人研究进展】至今，有关家畜卵母细胞体外成熟培养体系中添加外源抗氧化剂的研究已有较多报道。Bormann等（2003）研究发现，在成熟液中添加适量的维生素能提高山羊卵母细胞达MII期的比率及胚胎发育率。Tao等（2004）研究发现，维生素C和E对猪卵母细胞体外成熟有促进作用，可提高其体外成熟率。Gasparrini等（2006）报道，将半胱胺和胱氨酸添加至体外成熟液中，有利于卵母细胞减数分裂，提高其成熟率。Wang等（2007）研究表明，添加10和15 μmol/L绿茶多酚可促进牛卵母细胞第一极体排出，获得更高的体外发育率。彭中友等（2015）研究表明，猪卵母细胞体外成熟液中添加生长分化因子9（GDF9）一定程度上能提高卵母细胞及胚胎的发育能力，同时添加GDF9和抗卵泡抑素（FST）抗体对胚胎发育的促进作用具有加性效应。有关EGCG在哺乳动物体外受精研究方面的应用也有报道，Roth等（2008）研究表明，EGCG可增强胚胎抵抗母体熱应激的能力，促进小鼠胚胎发育；Spinaci等（2008）研究发现，在猪体外受精过程中，EGCG可减少H2O2产生，且以添加10 μg/mL的效果最佳；尚利青等（2009）研究表明，EGCG能促进山羊卵母细胞体外成熟；李拥军等（2012）研究发现，在小鼠HTF和TCM-199两种体系中添加20 μmol/L的EGCG能提高卵母细胞体外成熟率、精子受精率和胚胎发育率。【本研究切入点】EGCG具有很强的抗氧化性，能清除健康细胞中的活性氧（ROS），保护细胞和DNA免受损害，且能作用于与自由基有关的酶类，从而改善细胞质量及提高体外发育能力，但将EGCG用于水牛卵母细胞体外成熟培养的研究尚无报道。【拟解决的关键问题】在水牛卵母细胞体外成熟液中添加不同浓度的EGCG，探讨EGCG对提高卵母细胞成熟质量与早期胚胎发育能力的影响，以期进一步优化水牛体外胚胎生产体系及提高其体外胚胎生产效率。

1 材料与方法

1. 1 卵母细胞体外成熟

水牛卵巢收集于南宁某屠宰场，卵母细胞的采集和体外成熟参照蒋丽等（2013）的方法。EGCG购自成都普瑞发科技开发有限公司，纯度99.4%。水牛卵母细胞体外成熟液添加EGCG的浓度分别为0（CK）、5、10、20和30 μmol/L。

1. 2 卵丘扩展评定及卵母细胞成熟判定

卵丘扩展评定及卵丘扩展指数（Cumulus expansion index，CEI）计算参照Fagbohun和Downs（1990）的方法。卵母细胞成熟的判定标准为第一极体是否排出。水牛卵母细胞体外成熟22～24 h，去除卵丘细胞后，即可在体视显微镜下观察第一极体的排出情况。

1. 3 卵母细胞内活性氧（ROS）水平测定

选用索来宝（CA1410）活性氧检测试剂盒进行ROS水平测定。其原理为活性氧可将无荧光的二氯二氢荧光素—乙酰乙酸酯（DCFH-DA）氧化成可发出荧光的二氯荧光黄（DCF），通过激光共聚焦显微镜拍照，然后根据DCF荧光强度记录细胞内ROS水平。

1. 4 卵母细胞内谷胱甘肽（GSH）含量测定

选用总谷胱甘肽检测试剂盒进行GSH含量测定。单个卵母细胞GSH含量（pmol/枚）=样本总含量/测定卵母细胞总数。

1. 5 孤雌激活与体外受精

孤雌激活采用化学激活法，将体外培养获得的水牛MII期卵母细胞置于添加5 μmol/L离子酶素的洗卵液中激活5 min，再转移至2 mmol/L的6-DMAP培养液中培养6 h，经培养液洗2～3次后置于单层颗粒中共培养。体外受精参照蒋丽等（2013）的方法。孤雌激活和体外受精胚胎均隔天更换一半培养液，第3 d统计卵裂率，第6～8 d统计囊胚发育率。

1. 6 统计分析

试验数据均采用PASW Statistics 17.0软件进行单因素ANOVA分析。

2 结果与分析

2. 1 成熟液中添加EGCG对水牛卵母细胞卵丘扩展的影响

如表1所示，10和20 μmol/L处理组水牛卵母细胞的CEI分别为2.49%和2.42%，均显著高于CK组（P<

0.05，下同），而5和30 μmol/L处理组的CEI与CK组间无显著差异（P>0.05，下同）。说明成熟液中添加10～20 μmol/L EGCG有利于水牛卵母细胞体外成熟过程中卵丘的扩展。

2. 2 成熟液中添加EGCG对水牛卵母细胞体外成熟率的影响

第一极体排出是卵母细胞从GV期发育到MII期的标志，也是评定卵母细胞成熟的标准。如表2所示，10和20 μmol/L处理组的水牛卵母细胞成熟率（59.31%和50.98%）显著高于CK组（45.26%），且二者间差异显著；5和30 μmol/L处理组的水牛卵母细胞成熟率（47.04%和42.81%）与CK组的差异不显著。说明成熟液中添加10～20 μmol/L EGCG能有效促进水牛卵母细胞第一极体的排出。

2. 3 成熟液中添加EGCG对水牛MII期卵母细胞ROS水平的影响

由表3可以看出，20和30 μmol/L EGCG处理组水牛MII期卵母细胞ROS的DCF荧光强度分别为18.77和25.39，与CK组（38.04）间存在显著差异；虽然10 μmol/L EGCG处理组水牛MII期卵母细胞ROS的DCF荧光强度（28.90）也呈下降趋势，但与CK组的差异不显著；5 μmol/L EGCG处理组与CK组的DCF荧光强度基本一致。说明在成熟液中添加20～30 μmol/L EGCG可显著降低水牛MII期卵母细胞的ROS水平。

2.4 成熟液中添加EGCG对水牛MII期卵母细胞GSH含量的影响

由表4可以看出，在成熟液中添加EGCG后，各处理组水牛MII期卵母细胞的GSH含量均高于CK组，其中5、10和20 μmol/L处理组（3.03、3.21和3.25 pmol/枚）显著高于CK组，但这3个处理组间差异不显著。说明在成熟液中添加EGCG不仅能促进水牛卵母细胞成熟，还能提高卵母细胞的GSH合成能力。

2. 5 成熟液中添加EGCG对水牛卵母细胞孤雌激活后发育潜力的影响

由表5可以看出，在成熟液中添加EGCG后，各处理组水牛MII期卵母细胞经孤雌激活处理，其卵裂率和囊胚发育率均高于CK组。其中，10 μmol/L处理组孤雌卵的卵裂率（67.07%）和囊胚发育率为（31.69%）均显著高于CK组。说明在成熟液中添加EGCG可促进水牛卵母细胞的核成熟，进而提高其早期胚胎发育能力。

2.6 成熟液中添加EGCG对水牛卵母细胞体外受精后发育潜力的影响

由表6可以看出，各EGCG添加处理组水牛MII期卵母细胞经体外受精处理后，其卵裂率和囊胚发育率均高于CK组。其中，10和20 μmol/L处理组的受精卵卵裂率分别为59.64%和53.78%，显著高于CK组（44.65%）；10 μmol/L处理组的囊胚发育率为24.68%，显著高于CK组（15.02%）。说明在成熟液中添加EGCG不仅能促进水牛卵母细胞成熟，还能提高卵母细胞的成熟质量及其受精能力。

3 讨论

卵丘细胞在卵母细胞的核成熟和胞质成熟中扮演重要角色（Tanghe et al.，2003）。Mattioli等（1988）報道，猪卵母细胞成熟后扩散的卵丘细胞能诱发精子发生顶体反应，从而有利于精子进入卵母细胞。Fukui（1990）、Kikuchi等（1993）也研究发现，精子进入卵子后雄原核的形成很大程度上取决于卵母细胞的成熟与受精过程中卵丘细胞的作用。可见，卵丘扩展对卵母细胞发育能力起着重要作用。本研究发现，在成熟液中添加一定浓度的EGCG能促进水牛卵母细胞卵丘扩展，提高水牛卵母细胞体外发育能力，与Mattioli等（1988）报道的研究结果一致。但Ralph等（1995）研究表明，牛卵母细胞的卵丘扩展并不依赖卵母细胞；Vergara等（1997）研究发现，分别以去除卵丘细胞与保留卵丘细胞的小鼠卵母细胞进行体外受精时无显著差异。这可能与当地环境气候、试验方法、动物体系等因素有关，因此卵母细胞与卵丘扩展的关系有待进一步研究。

EGCG是绿茶中主要且含量丰富的黄酮类物质，是一种天然无毒的强抗氧化剂（Fiorini et al.，2005；谷亚轻，2008），能与其他抗氧化剂相互作用而有效清除有害自由基（Leone et al.，2003；Singh et al.，2011；Jin et al.，2015）。本研究结果表明，在体外成熟液中添加20～30 μmol/L EGCG能显著降低水牛MII期卵母细胞的ROS水平，与Leone等（2003）的研究结果一致。添加30 μmol/L EGCG能显著减少水牛MII期卵母细胞的ROS水平，但对水牛卵母细胞成熟及早期发育效果没有显著影响，可能与过度清除ROS有关，卵母细胞的成熟和发育受氧化因子及相关酶类的同步影响，其主导或拮抗、协同等作用尚需进一步探究。

GSH是一种三肽硫醇，几乎存在于所有细胞中，主要功能是参与新陈代谢，可保护细胞抵抗活性氧中间体和自由基的危害。本研究在水牛卵母细胞体外成熟液中添加不同浓度的EGCG，结果发现MII期卵母细胞的GSH含量均有所增加。其中，5～20 μmol/L EGCG处理组的MII期卵母细胞GSH含量显著高于CK组，即EGCG促进了水牛卵母细胞体外成熟过程中GSH的合成，而有利于卵母细胞的后期发育。此外，本研究发现在体外成熟液中添加10 μmol/L EGCG能显著促进水牛卵母细胞的成熟和早期胚胎发育率，添加20 μmol/L EGCG虽然也能显著促进水牛卵母细胞第一极体排出，但经孤雌激活和体外受精后的早期胚胎发育潜力不及添加10 μmol/L EGCG的处理组。因此在本研究条件下，以成熟液中添加10 μmol/L EGCG对水牛卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育的效果最佳。

4 結论

EGCG作为一种植物源的抗氧化剂，可用于优化水牛卵母细胞体外成熟体系，能有效提高卵母细胞的成熟率和体外发育潜力，且以水牛体外成熟液中添加10 μmol/L EGCG的效果最佳。

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（責任编辑 兰宗宝）