浸浴硝唑尼特对刺激隐核虫的驱虫效果

樊海平　林煜　钟全福　秦志清

摘要：【目的】明确浸浴硝唑尼特（NTZ）对刺激隐核虫的驱虫效果，为其在水产养殖中的推广应用提供参考依据。【方法】将NTZ溶于二甲亚砜（DMSO）制成溶液，探讨NTZ对刺激隐核虫感染幼虫和滋养体的驱虫效果，并分析药物浓度、日换水量、硫酸铜（CuSO4）和渗透剂对其驱除刺激隐核虫滋养体的影响。【结果】NTZ对刺激隐核虫感染幼虫的杀灭作用随药物浓度的升高而逐渐提高，至20.0 μg/L时刺激隐核虫感染幼虫的死亡率达97.33%。经1.0 g/m3 NTZ浸浴72 h后，患病大黄鱼的刺激隐核虫滋养体完全脱落；NTZ与CuSO4配伍能有效提高药物对刺激隐核虫滋养体的驱除效果，以NTZ 1.2 g/m3+CuSO4 0.5 g/m3浸浴72 h后患病大黄鱼体表和鳃部均无刺激隐核虫滋养体寄生，病鱼存活率达100.00%；渗透剂氮酮和换水方式与NTZ驱除刺激隐核虫滋养体的效果无相关性。【结论】NTZ浸浴鱼体能有效驱杀刺激隐核虫滋养体，尤其与CuSO4配伍可有效提高药物对刺激隐核虫滋养体的驱除效果，生产中建议使用剂量为NTZ 1.2 g/m3+CuSO4 0.5 g/m3。

关键词： 刺激隐核虫；硝唑尼特；大黄鱼；浸浴；驱虫效果

中图分类号： S941.51 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）03-0489-05

0 引言

【研究意义】刺激隐核虫（Cryptocaryon irritans Brown）又称海水小瓜虫（Ichthyophthirius marinus），隶属于原生动物门、纤毛亚门、寡膜纤毛纲、膜口亚纲、膜口目、凹口科、隐核虫属（许丹和刘兴旺，2014）。除黄斑蓝子鱼（Siganus oramin）等少数鱼类外，刺激隐核虫能感染大部分海水硬骨鱼类，且易导致大量死亡，对海水养殖业的危害极其严重（Wang et al.，2010）。在我国大黄鱼（Pseudosciaena crocea）养殖生产中，刺激隐核虫的发病死亡率高达60%～100%（王国良等，2013），流行季节病死率在80%以上，每年造成的经济损失在2亿元以上（苏跃中，2009）。因此，寻找可有效防治刺激隐核虫病的新型药物对保障海水产养殖业可持续发展具有重要意义。【前人研究进展】目前，水产养殖生产中预防刺激隐核虫病的常见措施有强化营养提高鱼体免疫力、降低养殖密度、定期消毒等（陆建学等，2007）。此外，也有采用硫酸铜、奎宁、亚甲蓝、苯扎氯铵、苯氧乙醇、福尔马林（Pironet and Jones，2000；Hirazawa et al.，2003）及四环素（Reichenbach-Klinke，1978）、中草药（陈章群，2005）、乙酸（邬阳等，2013）等进行浸浴治疗。Reichenbach-Klinke（1978）提出，将病鱼放在13 mg/L四环素溶液中浸浴30 s可杀死部分刺激隐核虫；陈章群（2005）用槟榔、苦参和苦楝等中草药配伍，熬制汤药后全池泼洒，4 d后患有刺激隐核虫病的红鳍东方鲀体表白点消失，治愈率达90%；邬阳等（2013）研究表明，使用157.4 mg/L乙酸累计处理2 h可有效杀灭全部刺激隱核虫幼虫；马宁等（2015）研究了18种中草药浸出液在体外对刺激隐核虫幼虫和包囊的杀灭效果，结果发现以辣椒和槟榔的杀虫效果最佳，而牵牛子、贯众、黄柏、茯苓、荆芥、熟地黄、鹤虱没有杀虫效果。【本研究切入点】硝唑尼特（Nitazoxanide，NTZ）是一种新型广谱、高效抗寄生虫和微生物药物，对多种原虫、吸虫、线虫、蠕虫感染和敏感肠道菌感染有特效，且安全性高、应用范围广（董靖等，2010）。但目前仅见NTZ对斑马鱼的急性毒性试验报道（张德利等，2011），对其他水产动物的毒性及对鱼类寄生虫的驱杀效果鲜见研究报道。【拟解决的关键问题】探讨NTZ对刺激隐核虫感染幼虫和滋养体的驱虫效果，并分析药物浓度、日换水量、硫酸铜（CuSO4）和渗透剂对其驱除刺激隐核虫滋养体的影响，以期为NTZ在水产养殖中的推广应用提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

NTZ（生产批号20150217XZ，纯度在98%以上）购自湖北巨胜科技有限公司，试验时按1∶5（g/mL）比例溶于二甲基亚砜（DMSO，天津恒兴化学试剂制造有限公司）；氮酮（纯度在98%以上）购自南京峰云化工有限公司；CuSO4（分析纯）购自天津恒兴化学试剂制造有限公司；盐酸土霉素（纯度在98%以上）购自陕西正大生物科技有限公司。大黄鱼由福建福鼎海鸥水产食品有限公司网箱养殖基地提供，其规格为50～130 g/尾，抽样检查发现鱼体表和鳃部寄生有大量刺激隐核虫；经活水船运回实验室后，暂养于直径为1.0 m的玻璃钢桶中，连续充气增氧，每天换水1次（砂滤），每次换水30%左右；暂养2～3 d后检查，虫体数量不断增加，即可用于后续试验。

1. 2 刺激隐核虫感染幼虫培养

收集从大黄鱼体表和鳃部脱落的刺激隐核虫包囊，于25 ℃下孵化40 h后可获得感染幼虫，海水调整幼虫浓度至1000个/mL。

1. 3 NTZ对刺激隐核虫感染幼虫的杀灭试验

将DMSO溶解的NTZ用海水分别稀释至2.0、4.0、10.0、20.0和40.0 μg/L，各取50.0 μL加至96孔细胞板中，然后加入刺激隐核虫感染幼虫液50.0 μL，NTZ终浓度为1.0、2.0、5.0、10.0和20.0 μg/L，每个浓度梯度设3个重复。培养板放入25 ℃培养箱内培养4 h后，倒置显微镜下观察刺激隐核虫感染幼虫的死亡情况。

1. 4 NTZ对刺激隐核虫滋养体的驱虫试验

设NTZ 0.5 g/m3、NTZ 1.0 g/m3、NTZ 0.5 g/m3+ CuSO4 0.5 g/m3及无药对照组（CK），每组6尾病鱼，3个重复。试验期间连续充气增氧，水温控制在26～27 ℃，每隔24 h换水补药（1/2）一次。共浸浴72 h，每日记录鱼体死亡情况，并分别于浸浴48和72 h取全鳃镜检刺激隐核虫滋养体数量。

1. 5 NTZ驱除刺激隐核虫滋养体的正交试验

选取NTZ浓度（0、1.0和1.6 g/m3）、日换水量（0、40%和70%）、CuSO4（0、0.3和0.6 g/m3）和渗透剂氮酮（0、0.3和0.6 g/m3）4个因素进行正交试验（表1），每组20尾大黄鱼苗（规格6～8 cm）。试验在盛有50 L海水的150 L塑料桶内进行，试验期间连续充气增氧，水温控制在26～27 ℃，每隔24 h换水补药（1/2）一次。共浸浴72 h，分别于浸浴24、48和72 h取病鱼的鳃、鳍和30%左右体表黏液进行镜检，每组每次取病鱼3尾。

1. 6 NTZ与CuSO4配伍对刺激隐核虫滋养体的驱虫试验

设NTZ 2.0 g/m3+CuSO4 0.5 g/m3、NTZ 1.5 g/m3+ CuSO4 0.5 g/m3及无药对照组（CK），每组15尾病鱼。试验期间连续充气增氧，水温控制在26～27 ℃，每隔24 h换水补药（1/2）一次。共浸浴72 h，分别于浸浴48和72 h取病鱼全鳃和30%左右黏液检查刺激隐核虫滋养体寄生情况。同时，以NTZ 1.2 g/m3+CuSO4 0.5 g/m3对刺激隐核虫感染率达100%且出现轻度烂鳃和鳞片脱落的大黄鱼苗（规格6～8 cm）进行驱虫治疗。

2 结果与分析

2. 1 NTZ对刺激隐核虫感染幼虫的杀灭效果

由表2可以看出，在4 h内1.0 μg/L NTZ对刺激隐核虫感染幼虫无杀灭作用，但随药物浓度的升高，其杀灭能力逐渐提高，至20.0 μg/L时刺激隐核虫感染幼虫的死亡率达97.33%。

2. 3 NTZ驱除刺激隐核虫滋养体的正交试验结果

由表4可以看出，NTZ驱除刺激隐核虫滋养体的效果与药物浓度呈正相关，即药物浓度越高，其驱除刺激隐核虫滋养体的效果越佳；NTZ与CuSO4配伍可明显提高其对刺激隐核虫滋养体的驱除效果，呈叠加效应；渗透剂氮酮和日换水量与NTZ驱除刺激隐核虫滋养体的效果无相关性。

2. 4 NTZ与CuSO4配伍对刺激隐核虫滋養体的驱除效果

由表5可以看出，NTZ 2.0 g/m3+CuSO4 0.5 g/m3和NTZ 1.5 g/m3+CuSO4 0.5 g/m3处理组病鱼经浸浴24、48和72 h的死亡率分别为6.67%、20.00%、26.67%和6.67%、19.67%、26.33%；而CK组病鱼在浸浴24、48和72 h的死亡率分别为13.33%、73.33%和100.00%。浸浴48和72 h后检查试验组大黄鱼的体表和鳃，未发现有刺激隐核虫滋养体寄生；而CK组48 h时检查大黄鱼的体表和鳃，发现仍有大量刺激隐核虫滋养体寄生。以NTZ 1.2 g/m3+CuSO4 0.5 g/m3对刺激隐核虫感染率达100%且出现轻度烂鳃和鳞片脱落的大黄鱼苗进行驱虫治疗，病鱼存活率达100.00%，浸浴48 h检查发现病鱼的鳃和体表有少量刺激隐核虫滋养体寄生，浸浴72 h后大黄鱼体表和鳃部已无刺激隐核虫滋养体寄生。

3 讨论

NTZ为口服药物，是第一个被美国食品和药品管理局（FDA）批准为专门用于治疗隐孢子虫感染的药物（刘耀文，2003），其优点是既可驱治多种蠕虫，又可驱治原虫（主要是肠道及腔道寄生原虫）（沈一平等，2006），但至今其药效作用机制尚未明确。根据药物活性谱研究结果可知，NTZ首先对厌氧或微需氧虫种有效，其结构特征与氯氰碘柳胺及其相关化合物相似，与阿苯达唑、甲苯达唑和甲硝唑相比，NTZ的抗寄生虫谱与抗菌谱更广（张可煜等，2007）。在国外，NTZ主要用于治疗犬、猫的蠕虫感染（赵占中，2009）；而国内的研究表明，NTZ对犬、羊、鸡、兔、鼠等动物体内的寄生虫均有治疗作用（赵占中，2009；Zhang et al.，2010）。本研究通过对大黄鱼刺激隐核虫进行药物浸浴驱杀试验，结果证实NTZ浸浴鱼体能有效驱杀刺激隐核虫滋养体，也佐证了该药在水产寄生虫病防治中应用的可能性。

CuSO4对刺激隐核虫的有效性已得到证实（潘孝益等，1994；毛国民等，2005；陆建学等，2007）。本研究通过TNZ与CuSO4配伍，既充分发挥TNZ对寄生虫幼虫和滋养体的杀灭作用及对包囊的抑制作用，又兼顾CuSO4对刺激隐核虫成虫和幼虫的杀灭作用，结果显示，以NTZ 1.2 g/m3+CuSO4 0.5 g/m3对感染刺激隐核虫且出现轻度烂鳃和鳞片脱落的大黄鱼苗进行浸浴治疗，病鱼存活率达100.00%，浸浴72 h后大黄鱼体表和鳃部已无刺激隐核虫滋养体寄生。可见，TNZ与CuSO4配伍可有效提高药物对刺激隐核虫滋养体的驱除效果。

本研究结果表明，通过浸浴驱杀刺激隐核虫，除部分虫体被杀灭外，大部分滋养体在药物作用下迅速形成包囊并脱离鱼体。这些脱落的刺激隐核虫包囊经过一段时间的发育，又能孵化出感染幼虫重复感染鱼体，且感染幼虫数量较原滋养体数量呈几百倍增长，重复感染对鱼体危害更严重。因此，实际生产中要有效控制刺激隐核虫重复感染，可用水流将脱落的刺激隐核虫包囊冲出养殖区，并集中进行杀灭处理，且必须在包囊孵出感染幼虫前进行杀灭处理等。

4 结论

NTZ浸浴鱼体能有效驱杀刺激隐核虫滋养体，尤其与CuSO4配伍可有效提高药物对刺激隐核虫滋养体的驱除效果，生产中建议使用剂量为NTZ 1.2 g/m3+

CuSO4 0.5 g/m3。

参考文献：

陈章群. 2005. 利用中草药防治红鳍东方鲀刺激隐核虫病[J]. 中国水产，（5）：51-52.

Chen Z Q. 2005. Utilization of Chinese herbal medicine to control Takifugu rubripes infected by Cryptocaryon irritans[J]. Chinese Aquatic Products，（5）：51-52.

董靖，邓旭明，邓彦宏. 2010. 抗寄生虫新药硝唑尼特研究进展[J]. 中国兽药杂志，44（5）：51-53.

Dong J，Deng X M，Deng Y H. 2010. Progress of a new antiparasite drug nitazoxanide[J]. Chinese Journal of Veterinary Drug，44（5）：51-53.

刘耀文. 2003. 2002年美国FDA批准的新药及生物制品[J]. 国外医药（药学分册），30（3）：192-193.

Liu Y W. 2003. New drug and biological products approved by U.S. FDA in 2002[J]. Foreign Medical Sciences Section on Pharmacy，30（3）：192-193.

陆建学，辛俭，周凯，楼宝，夏连军，毛国民. 2007. 黄鲷刺激隐核虫的防治研究[J]. 渔业现代化，（2）：32-34.

Lu J X，Xin J，Zhou K，Lou B，Xia L J，Mao G M. 2007. Research on prevention and treatment of Cryptocaryon irritans on Taius tumifrons[J]. Fishery Modernization，（2）：32-34.

马宁，黎铭，李旻，曾地刚. 2015. 中草药浸出液体外杀灭刺激隐核虫的效果[J]. 江西农业学报，27（11）：95-98.

Ma N，Li M，Li M，Zeng D G. 2015. Killing effect of chinese herbal leachate on Cryptocaryon irritans in vitro[J]. Acta Agriculturae Jiangxi，27（11）：95-98.

毛国民，辛俭，於海滨，史海东. 2005. 黑鲷Sparus macrocephalus （Basilewsky）刺激隱核虫（Cryptocaryon irritans）的防治研究[J]. 现代渔业信息，20（9）：24-25.

Mao G M，Xin J，Yu H B，Shi H D. 2005. A study on prevention and treatment of Cryptocaryon irritans on Sparus marcrocephalus（Basilewsky）[J]. Modern Fisheries Information，20（9）：24-25.

潘孝益，施卫旭，邝国辉. 1994. 海水养殖鱼类暴发刺激隐核虫病的诊治报告[J]. 中国动物检疫，11（6）：16-17.

Pan X Y，Shi W X，Kuang G H. 1994. Diagnosis and treatment report on outbreaks of marine fishes infected by Cryptocaryon irritans[J]. China Animal Quarantine，11（6）：16-17.

沈一平，管晓虹，冯振卿. 2006. 广谱抗肠道寄生虫药硝唑尼特（nitazoxanide）研究进展[J]. 国际医学寄生虫病杂志，33（4）：221-224.

Shen Y P，Guan X H，Feng Z Q. 2006. The progress in investigation of a broad-spectrum intestinal antiparasitic drug-nitazoxanide[J]. International Journal of Medical Parasitic Di-

seases，33（4）：221-224.

苏跃中. 2009. 福建省主要养殖区海水网箱养殖鱼类刺激隐核虫病的调查及防控对策[J]. 水产科技情报，36（1）：4-7.

Su Y Z. 2009. Investigation of fishes cultured marine cage infected by Cryptocaryon irritans in main mariculture areas and its prevention and control in Fujian[J]. Aquatic Science and Technology Information，36（1）：4-7.

王国良，周曼曦，徐益军. 2013. 刺激隐核虫LAMP检测方法的建立[J]. 中国预防兽医学报，35（7）：574-577.

Wang G L，Zhou M X，Xu Y J. 2013. Establishment of the loop-mediated isothermal amplification for the detection of Cryptocaryon irritans[J]. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine，35（7）：574-577.

邬阳，牛素芳，金媛，毛勇，苏永全. 2013. 闽东海域刺激隐核虫的生活史观察及乙酸杀虫效果[J]. 厦门大学学报（自然科学版），52（2）：281-288.

Wu Y，Niu S F，Jin Y，Mao Y，Su Y Q. 2013. Observation on the life history of Cryptocaryon irritans in Eastern Sea of Fujian and research on antiparasitic effect of acetic acid[J]. Journal of Xiamen University（Natural Science），52（2）：281-288.

许丹，刘兴旺. 2014. 刺激隐核虫病害情况分析与防控措施探讨[J]. 海洋与渔业，（1）：68-69.

Xu D，Liu X W. Situation，prevention and control measures of Cryptocaryon irritans[J]. Marine and Fishery，（1）：68-69.

张德利，吴永魁，张西臣. 2011. 硝唑尼特对斑马鱼和赤子爱胜蚓的急性毒性试验[J]. 动物医学进展，32（7）：121-124.

Zhang D L，Wu Y K，Zhang X C. 2011. Acute toxicity test of nitazoxanide on Brachydanio rerio and Eisenia foetida[J]. Pro-

gress in Veterinary Medicine，32（7）：121-124.

张可煜，王国永，薛飞群. 2007. 抗寄生虫新药硝唑尼特研究进展[J]. 兽医导刊，（12）：30-32.

Zhang K Y，Wang G Y，Xue F Q. 2007. Research progress of new anti-parasitic drug nitazoxanide[J]. Veterinary Orientation，（12）：30-32.

赵占中. 2009. 硝唑尼特在山羊体内的药物代谢动力学及毒理学研究[D]. 北京：中国农业科学院.

Zhao Z Z. 2009. Study on pharmacokinetics and toxicology of nitazoxanide in goats[D]. Beijing：Chinese Academy of Agricultural Sciences.

Hirazawa N，Goto T，Shirasu K. 2003. Killing effect of various treatments on the monogenean Heterobothrium okamotoi eggs and oncomiraddia and the ciliate Cryptocaryon irritans cysts and theronts[J]. Aquaculture，223（1-4）：1-13.

Pironet F N，Jones J B. 2000. Treatments for ectoparasites and diseases in captive Wetem Australian dhufish[J]. Aquaculture International，8（4）：349-361.

Reichenbach-Klinke H H. 1978. Fish Pathology[M]. London： Bailliere Tindall.

Wang F H，Xie M Q，Li A X. 2010. A novel protein isolated from the serum of rabbitfish（Siganus oramin） is lethal to Cryptocaryon irritans[J]. Fish & Shellfish Immunology，29（1）：32-41.

Zhang R Y，Shang L M，Jin H T，Ma C P，Wu Y K，Liu Q，Xia Z P，Wei F，Zhu X Q，Gao H. 2010. In vitro and in vivo antileishmanial efficacy of nitazoxanide against Leishmania donovani[J]. Parasitology Research，107（2）：475-479.

（責任编辑 兰宗宝）