槲皮素对肾性高血压大鼠的降压作用及机制研究

侯国军，秦小江，侯晓敏，赵晓园，赵良渊

槲皮素对肾性高血压大鼠的降压作用及机制研究

侯国军1，秦小江2，侯晓敏2，赵晓园3，赵良渊2

1.武警太原市支队卫生队(太原 030024)；2.山西医科大学；3.天津大学

摘要：目的探讨槲皮素对肾性高血压大鼠的降压作用及其机制。方法将30只肾性高血压大鼠随机分为3组，每组10只。空白对照组：正常喂养；槲皮素组：正常喂养+槲皮素30 mg/(kg·d)；维拉帕米组：正常喂养+维拉帕米30 mg/(kg·d)。喂养8周，每两周比较一次3组大鼠的血压；8周后，采用离体微血管环张力记录仪，观察各组大鼠的肾动脉血管环对KCl及生理性刺激剂血栓素A2类似物(U-46619)的收缩反应，并急性分离大鼠肾动脉血管平滑肌细胞，采用激光共聚焦观察各组大鼠的肾动脉平滑肌细胞对KCl的反应，比较其荧光密度比率。结果膳食补充槲皮素能够降低肾性高血压大鼠的血压，与空白对照组相比，血压下降了(15.9±3.4)%，差异有统计学意义(P<0.05)；与空白对照组相比，槲皮素组的肾动脉血管环，对60 mmol/L KCl和10-7mol/L U46619的收缩幅度均明显降低，分别降低了(32.6±4.7)%和(26.8±3.2)%，差异有统计学意义(P<0.05)；与空白对照组相比，槲皮素组的肾动脉血管环平滑肌细胞内的游离钙离子荧光密度比率下降了(20.4±3.5)% ，差异有统计学意义(P<0.05)。 结论黄酮类化合物槲皮素能降低肾性高血压大鼠的血压；其机制与降低肾动脉平滑肌细胞内游离钙离子浓度有关。

关键词：肾性高血压；槲皮素；钙离子；维拉帕米；血管平滑肌细胞

黄酮类化合物槲皮素广泛分布于植物中，能够治疗多种疾病，如关节炎、细菌感染、哮喘、癌症等[1-4]。有研究报道，槲皮素能够舒张离体大鼠的肠系膜动脉、主动脉和冠状动脉[5-7]，可降低自发性高血压大鼠的血压[8]，但对肾性高血压大鼠的降压作用却鲜见报道。本课题通过膳食补充槲皮素，观察槲皮素对肾性高血压大鼠的降压作用，并进一步通过肾动脉血管环和肾动脉平滑肌细胞探讨其机制。

1材料与方法

1.1药品与试剂槲皮素(纯度≥98%)、血栓素A2类似物(U-46619)、EGTA、HEPES、白蛋白、木瓜蛋白酶、二硫丁四醇、胶原蛋白F、胶原蛋白H：均为Sigma公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2实验动物雄性肾性高血压大鼠30只，体重150g～170 g，购自山西医科大学实验动物中心。将动物随机分为3组，每组10只。对照组给予正常喂养；槲皮素组在正常喂养的前提下，加喂槲皮素30 mg/(kg·d)；维拉帕米组在正常喂养的前提下，加喂维拉帕米30 mg/(kg·d)。

1.3实验仪器多通道动物无创血压测量系统：南京德宝生化器材有限公司；微血管张力记录仪：丹麦DMT公司；激光共聚焦显微镜：日本Olympus公司。

1.4多通道动物无创血压测量基本实验程序将清醒状态的大鼠置于加热箱内，将尾部固定于连接装置上，预热10 min后测量其平均动脉压，连续测量3次，取其平均值。

1.5离体肾动脉血管环的制备及实验程序大鼠麻醉后，放血，迅速取其肾脏，置于4 ℃且氧气饱和的磷酸缓冲盐溶液(PSS)中。解剖显微镜下钝性分离其肾动脉，找到三级分支，然后剪成长度约为2 mm的肾动脉血管环。将血管环通过两根直径为40 μm的钢丝固定于微血管张力记录仪上。浴槽内的PSS液维持37 ℃恒温。调整肾动脉血管环的前负荷到80 mmHg，平衡1 h后开始正式试验。用60 mmol/L KCl收缩血管环达坪台，连续刺激血管环3次，当3次的收缩幅度相差不超过10%时，认为血管反应良好，选取收缩张力达到2 mN的肾动脉血管环进行正式实验。观察各组大鼠肾动脉血管环对60 mmol/L KCl及10-7mol/L U46619的收缩反应[7，9-10]。

1.6大鼠肾动脉平滑肌细胞分离过程用两步酶解法分离得到大鼠肾动脉血管平滑肌细胞。先将肾动脉血管环浸入Ⅰ号酶解液：低钙(0.1 mmol/L CaCl2)的HEPES液，含1 mg/mL白蛋白，0.5 mg/mL木瓜蛋白酶和1 mg/mL二硫丁四醇孵育30 min。然后将肾动脉血管环浸入Ⅱ号酶解液：无钙HEPES液，含有1 mg/mL白蛋白，0.5 mg/mL胶原蛋白F和0.5 mg/mL胶原蛋白H，孵育约15 min。用吸管将单个细胞从血管环骨架上轻轻吹打下来，1 000 r/min离心3 min，分离好的肾动脉血管平滑肌细胞用于激光共聚焦实验。

将细胞用Fluo-4-AM染色，测量加入40 mmol/L KCl 后，3组大鼠肾动脉平滑肌细胞内游离钙离子浓度。使用激光共聚焦显微镜，首先观察并记录静息状态下离体大鼠肾动脉血管平滑肌细胞的荧光强度，然后用40 mmol/L KCl灌流细胞，记录当荧光轨迹达到坪台时的荧光强度。

2结果

2.1槲皮素对肾性高血压大鼠血压的影响8周内，空白对照组肾性高血压大鼠的血压仍在不断升高，从开始的163 mmHg±3 mmHg升高到194 mmHg±5 mmHg。槲皮素组8周后大鼠的血压从165 mmHg±5 mmHg降低到163 mmHg±7 mmHg，与空白对照组相比，8周末的血压降低了(15.9±3.4)%。维拉帕米组的血压从164 mmHg±4 mmHg降低到148 mmHg±4 mmHg。详见图1。

与空白对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。

图1槲皮素对肾性高血压大鼠血压的影响

2.2各组大鼠肾动脉血管环对KCl和U46619的收缩反应60 mmol/L KCl可引起各组肾性高血压大鼠的肾动脉血管环发生收缩，其最大收缩幅度：空白对照组为4.3 mN±0.8 mN，槲皮素组为2.9 mN±0.4 mN，维拉帕米组为2.7 mN±0.6 mN。槲皮素喂养后，明显降低了60 mmol/L KCl对大鼠肾动脉血管环的收缩效果，与空白对照组相比，其最大收缩幅度下降了(32.6±4.7)%。详见图2。

10-7mol/L U46619可引起各组肾性高血压大鼠的肾动脉血管环发生收缩，其最大收缩幅度：空白对照组为4.1 mN±0.3 mN，槲皮素组为3.0 mN±0.5 mN，维拉帕米组为2.6 mN±0.4 mN。槲皮素喂养后，明显降低了10-7mol/L U46619对大鼠肾动脉血管环的收缩效果，与空白对照组相比，其最大收缩幅度下降了(26.8±3.2)%。详见图3。

注：与空白对照组相比，*P<0.05。

图2KCl对各组肾性高血压大鼠肾动脉血管环的收缩效果

注：与空白对照组相比，*P<0.05。

图3U46619对各组肾性高血压大鼠肾动脉血管环的收缩效果

2.3加入KCl后各组大鼠肾动脉平滑肌细胞内的游离钙离子荧光密度静息状态下，各组大鼠肾动脉血管平滑肌细胞的荧光强度接近。当用40 mmol/L KCl灌流细胞时，3组大鼠的肾动脉血管平滑肌细胞荧光强度均发生一定程度的升高，当荧光轨迹达到坪台时，各组细胞的荧光密度比率(F/F0)：空白对照组为2.5±0.1，槲皮素组为2.0±0.2，维拉帕米组为1.5±0.2。与空白对照组相比，槲皮素组肾动脉血管平滑肌细胞内游离钙离子的荧光密度比率下降了(20.4±3.5)%。详见图4。

注：与空白对照组相比，*P< 0.05。

图3各组肾性高血压大鼠肾动脉血管平滑肌细胞的

荧光密度比率。

3讨论

槲皮素存在于多种水果、蔬菜中，如葡萄、苹果、沙棘、番茄、洋葱等，属于黄酮类化合物。西方人的每日饮食中，大约含有13.82 mg槲皮素[11]。

有研究报道，槲皮素可以降低自发性高血压大鼠的血压[8]，本课题中，给肾性高血压大鼠膳食补充槲皮素，喂养8周期间，大鼠血压发生了一定程度下降，在喂养8周末，与空白对照组相比，槲皮素组大鼠的血压下降了(15.9±3.4)%。

为了进一步研究其降血压机制，本研究观察了KCl和U46619对3组大鼠肾动脉血管环的收缩效果，发现膳食补充槲皮素组大鼠肾动脉血管环对这两种收缩剂的反应均发生了一定程度的下降。KCl使细胞膜发生去极化，通过激活L-型电压依赖性钙通道引起细胞内钙离子浓度升高，血管收缩[12-13]。U46619为血栓素A2类似物，可引起肾动脉血管环发生收缩。补充槲皮素后，与空白对照组相比，60 mmol/L KCl对肾动脉血管环的收缩幅度下降了(32.6±4.7)%，10-7mol/L U46619对肾动脉血管环的收缩幅度下降了(26.8±3.2)%。钙离子通过L-型电压依赖性钙通道进入细胞，进而引起动脉发生收缩[14]。激光共聚焦实验可以反映细胞内的游离钙离子浓度，本实验结果显示，补充槲皮素组的肾动脉血管平滑肌细胞，在加入KCl后，其荧光密度比率低于空白对照组，降低了(20.4±3.5)%。提示膳食补充槲皮素能够一定程度上降低肾性高血压大鼠的血压，其机制与降低细胞内游离钙离子浓度有关，为了进一步探究其深层次的降压机制，今后将采用全细胞膜片钳实验技术观察槲皮素对大鼠肾动脉平滑肌细胞膜上相关通道电流的影响。

参考文献：

[1]Kim H，Mani I，Iversen L，et al.Effects of naturally-occurring flavonoids and biflavonoids on epidermal cyclooxygenase and lipoxygenase from guinea-pigs [J].Prostaglandins Leukotrienes and Essential Fatty Acids，1998，58(1)：17-24.

[2]Rigano D，Formisano C，Basile A，et al.Antibacterial activity of flavonoids and phenylpropanoids from Marrubium globosum ssp libanoticum [J].Phytotherapy Research，2007，21(4)：395-397.

[3]Thornhill SM，Kelly AM.Natural treatment of perennial allergic rhinitis [J].Alternative Medicine Review，2000，5(5)：448-454.

[4]Soobrattee MA，Bahorun T，Aruoma OI.Chemopreventive actions of polyphenolic compounds in cancer [J].Biofactors，2006，27(1-4)：19-35.

[5]Perez-Vizcaino F，Ibarra M，Cogolludo AL，et al.Endothelium-independent vasodilator effects of the flavonoid quercetin and its methylated metabolites in rat conductance and resistance arteries [J].The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics，2002，302(1)：66-72.

[6]Chen CK，Pace-Asciak CR.Vasorelaxing activity of resveratrol and quercetin in isolated rat aorta [J].General Pharmacology，1996，27(2)：363-366.

[7]Hou XM，Liu Y，Niu LG，et al.Enhancement of voltage-gated K+channels and depression of voltage-gated Ca2+channels are involved in quercetin-induced vasorelaxation in rat coronary artery [J].Planta Medica，2014，80(6)：465-472.

[8]Duarte J，Pérez‐Palencia R，Vargas F，et al.Antihypertensive effects of the flavonoid quercetin in spontaneously hypertensive rats [J].British Journal of Pharmacology，2001，133(1)：117-124.

[9]Liu Y，Chang H，Niu L，et al.Effects of propofol on responses of rat isolated renal arteriole to vasoactive agents [J].Vascular Pharmacology，2009，51(2)：182-189.

[10]Niu LG.，Zhang MS，Liu Y，et al.Vasorelaxant effect of taurine is diminished by tetraethylammonium in rat isolated arteries [J].European Journal of Pharmacology，2008，580(1)：169-174.

[11]Cao J，Zhang Y，Chen W，et al.The relationship between fasting plasma concentrations of selected flavonoids and their ordinary dietary intake[J].British Journal of Nutrition，2010，103(2)：249-255.

[12]Zhang P，Shi J，Shen B，et al.Stejnihagin，a novel snake metalloproteinase from Trimeresurus stejnegerin venom，inhibited L-type Ca2+channels [J].Toxicon，2009，53(2)：309-315.

[13]Yamazaki Y，Koike H，Sugiyama Y，et al.Cloning and characterization of novel snake venom proteins that block smooth muscle contraction [J].European Journal of Biochemistry，2002，269(11)：2708-2715.

[14]Bertolissi M，De Monte A，Giordano F.Comparison of intravenous nifedipine and sodium nitroprusside for treatment of acute hypertension after cardiac surgery [J].Minerva Anestesiologica，1997，64(7-8)：321-328.

(本文编辑郭怀印)

通讯作者：赵良渊，E-mail：sxykdxyxy@126.com

中图分类号：R544.1R255.3

文献标识码：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．02．009

文章编号：1672-1349(2016)02-0137-03

(收稿日期：2015-06-19)