李培珏, 侯晨晔, 李 勇, 孙 冰
1. 上海微创医疗器械(集团)有限公司, 上海 201203;2. 复旦大学生命科学学院, 上海 200433
荧光快检法用于工艺用水微生物检测的研究
李培珏1,2,侯晨晔1*,李勇1,孙冰1
1. 上海微创医疗器械(集团)有限公司, 上海 201203;2. 复旦大学生命科学学院, 上海 200433
摘要:为考察荧光快检法用于测定水中微生物的可行性,使用6种常见试验菌,比较用传统膜过滤法和荧光快检法对微生物计数的应用。结果表明使用荧光快检法的培养时间,金黄色葡萄球菌17 h,大肠埃希菌15 h,枯草芽孢杆菌16 h,白色念珠菌36 h,黑曲霉51 h,铜绿假单胞菌19 h,所有菌种回收率都大于70%,且通过分析显著性水平表明这两种方法无显著性差异。实验结果证明,荧光快检法可用于水中微生物的检测,可大大缩短培养周期,且检测结果准确。
关键词:工艺用水; 荧光染色; 微生物快检; 膜过滤法
对于食品、制药、医疗器械等行业,工艺用水在其整个生产过程中通常是一个重要的原辅料,其微生物的含量通常直接影响产品的质量。目前水中微生物计数方法通常采用膜过滤法[1]或者直接接种法[2],这类传统计数方法检测结果可靠,且易于操作,但是由于需要培养微生物至其形成肉眼可见菌落后才能进行计数,因此微生物的培养时间短则2 d,长至14 d。使用传统微生物计数方法由于其检测时间过长,导致检测结果滞后,不利于及时了解水中微生物状况,影响企业对微生物污染控制的时效性,会由于无法及时发现问题并采取纠正措施而增加产品的潜在微生物污染风险,甚至导致大量产品的报废,造成企业的巨大经济损失[3]。因此选用一种准确、灵敏、快速的微生物检测方法是目前企业所需要解决的重要且迫切的问题。
随着微生物学的迅速发展,不断有新的微生物检验技术被引入,来缩短微生物的培养时间[4-6]。本实验所选用的荧光快检法结合了荧光染色法和薄膜过滤法,使用的设备为EZ-FLUO快速微生物检测系统。该方法采用酶促反应荧光染色技术,整个检测过程不破坏微生物细胞。其标记试剂在细胞外,本身是不发荧光的,但转移进入活的微生物体内后,能被微生物的新陈代谢所利用,从而产生能被激发产生荧光的反应产物,随着产物的积累(产物本身不能被细胞主动转移出体外),荧光的量达到能被读数器所识别就能被准确的计数。
本实验中通过对六种常见微生物的传统膜过滤法和荧光快检方法的实验对比,以确定荧光快检法用于测定水中微生物的可行性。
1材料与方法
1.1设备
EZ-FLUOTM快速微生物检测系统:Merck Millipore;
三联过滤系统:Merck Millipore;
生物安全柜:SY-08-056,上海博迅实业有限公司;
生化培养箱:SPX-150BS-II,上海新苗医疗器械制造有限公司;
霉菌培养箱:MJ-160BS-II,上海新苗医疗器械制造有限公司;
立式蒸汽压力灭菌器:CL-32L,ALP。
1.2菌种
金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) (CMCC(B)26003);大肠埃希菌(EscherichiaColi) (CMCC(B) 44102);枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis) (CMCC(B)63501);白色念珠菌(Candidaalbicans) (CMCC(F)98001);黑曲霉(Aspergillusniger) (CMCC(F)98003);铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa) (CMCC(B)10104)。
以上菌种均为BioBall定量菌株:生物梅里埃公司。
1.3试剂及培养基
荧光染色液:Merck Millipore;
氯化钠:国药集团化学试剂有限公司;
营养琼脂培养基:广东环凯微生物科技有限公司;
玫瑰红钠琼脂培养基:广东环凯微生物科技有限公司。
1.4方法
1.4.1试验组设计
每次试验需进行以下三个试验组的数据统计。
F组:荧光快检组,按缩短的培养时间,进行荧光读数,所计得的菌落数;
V组:恢复生长组,荧光快检组的滤膜,经过荧光读数后,转移到新鲜培养基,继续培养至传统方法的时间点,进行肉眼观察,所计得的菌落数;
T组:传统对照组,按传统方法的时间培养,进行肉眼观察,所计得的菌落数;
阴性对照组:取稀释菌液所用生理盐水1 mL和冲洗用0.1%蛋白胨水溶液200 mL,过滤,每完成一组F组,V组或T组,均需附加一份阴性对照平皿。
表1 快检时间耐用性试验中标准菌株的F组,V组和T组的培养时间
取各个标准菌株的培养物,制备成约0~100 cfu/mL浓度范围的菌液。进行微生物过滤,培养和计数,每种菌株均选取三个不同快检时间点进行荧光染色计数。对于每个时间条件, F、V和T各组均测试5份平行的平板。
1.4.2荧光快检法操作步骤
-将实验菌液过滤至滤膜上
-将滤膜转移至固体培养基,培养至特定时间(F组培养时间)
-将滤膜再次转移至含有染色剂的培养皿上
-培养30 min,染色剂底物被酶切
-通过读数器读取荧光数量(即为F组读数)
-将滤膜重新转移至新鲜固体培养基上重新培养至特定时间(V组培养时间)后,菌落计数(即为V组读数)
1.4.3传统膜过滤法操作步骤
-将实验菌液过滤至滤膜上
-将滤膜转移至固体培养基,培养至特定时间(T组培养时间)
-菌落计数(即为T组读数)
1.4.4数据处理
1.4.4.1回收率考察
荧光快检组(F组)的单块平板回收率计算如下:
F组单块平板回收率=F组每块平板菌落数/T组平均菌落数×100%
以此得出1组共5份F单块平板回收率;三个快检时间点对应获得三组的F单块平板回收率结果。
恢复生长组(V组)数据同法处理:
V组单块平板回收率=V组单块平板菌落数/T组平均菌落数×100%
回收率不得低于70%。
1.4.4.2方差分析
在三个不同快检时间试验条件下,对各试验菌的F组或V组单块平板回收率进行比较,三组数据之间进行方差分析的多重比较(即Tukey法),确定其差异性。
2结果与讨论
2.1荧光快检法的荧光强度
在三个不同培养条件下,所有F组的平板均能表现出较好的发光强度。
6种微生物在设定的F组中间培养时间条件下,即:金黄色葡萄球菌培养17 h、大肠埃希菌培养15 h、枯草芽孢杆菌培养16 h、白色念珠菌培养36 h、铜绿假单胞菌培养19 h、黑曲霉培养51 h,F组的荧光图见图1和图2。
从图中可看出:
① 金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌经过设定的F组中间培养时间培养后,通过EZ-FLUO读数器能看出清晰可辨的亮点,通过计亮点的数量可容易地进行菌落计数。
② 铜绿假单胞菌经过19 h培养后,通过EZ-FLUO读数器看出的亮点大却不够清晰,发光强度不均匀。但从图中可看出,若增加培养时间,菌落变大则发光强度也随之增强,从而导致荧光点相互重叠,并不利于进行荧光点计数。因此认为19 h是较为合理的铜绿假单胞菌培养时间。
③ 黑曲霉经过51 h培养后,可以看出菌丝也出现了荧光,尽管发光强度比除铜绿假单胞菌外的其余4种微生物稍差,但是仍可通过EZ-FLUO读数器进行计数。考虑到增加培养时间可能出现菌丝过多而相互交集导致最终计数困难,因此认为51 h是较为合理的黑曲霉培养时间。
金黄色葡萄球菌培养17 h
大肠埃希菌培养15 h
枯草芽孢杆菌培养16 h
白色念珠菌培养36 h
铜绿假单胞菌培养19 h
图2铜绿假单胞菌、黑曲霉荧光图
2.2回收率和方差分析
6种微生物的所有F组或V组的单块平板回收率均大于70%。各组的单块平板回收率经正态分布检验,均服从正态分布;在三个不同快检时间试验条件下,各试验菌的F组或V组单块平板回收率进行比较,三组数据之间进行方差分析的多重比较,即Tukey法,经计算任意两总体均值差的置信区间,此区间均包含0,故任意两总体均值无显著差异。
各菌种回收率的结果见表2~7:
表2 金黄色葡萄球菌回收率
表3 大肠埃希菌回收率
表4 枯草芽孢杆菌回收率
表5 白色念珠菌回收率
表6 黑曲霉回收率
表7 铜绿假单胞菌回收率
3结论
通过对6种常见试验菌株的荧光快检法与传统膜过滤法的检测对比,可以看出在设定的培养时间条件下,回收率均大于70%,且没有显著性差异。
从荧光计数效果来看,金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的发光强度易被计数。铜绿假单胞菌经过19 h培养后,发光效果略差于以上4种微生物,但如继续培养,则发光强度增加的同时菌落也将逐渐变大,菌落过度交集反而不利于荧光计数,因此认为19 h是较为合理的铜绿假单胞菌的培养时间。黑曲霉经过51 h培养后,可以看出菌丝也出现了荧光,尽管发光强度较弱,但仍可计数,若增加培养时间可能出现菌丝过多而相互交集导致最终计数困难,因此认为51 h是较为合理的黑曲霉培养时间。
因此,使用荧光快检法,金黄色葡萄球菌培养17 h,大肠埃希菌培养15 h,枯草芽孢杆菌培养16 h,白色念珠菌培养36 h,黑曲霉培养51 h,铜绿假单胞菌培养19 h,可满足检测要求。
近年,微生物快速检测法越来越多地应用于食品、制药、医疗器械等行业中[7-10]。将该快检法应用与工艺用水的微生物计数中,可大大缩短传统的培养周期,很好的解决了微生物测试结果的滞后性,能快速发现结果是否有异常,降低了生产的风险。
参考文献
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Detection of microbiological contaminants in process water by fluorescence-based rapid detection method
LI Pei-jue1,2, HOU Chen-ye1, LI Yong1, SUN Bing1
1. Shanghai Microprot Medical(Group)Co.Ltd, Shanghai 201203, China;2. School of Life Sciences Fudan University. Shanghai 200433, China
AbstractThe application of fluorescent-based rapid detection method for microbiological contaminants in water was investigated, and then compared with the the membrane filtration method with six different test strains. The results showed that the culturing time by fluorescent rapid detection method were as follows: Staphylococcus aureus 17 h, Escherichia coli 15 h, Bacillus subtilis 16 h, Candida albicans 36 h, Aspergillus niger 51 h, Pseudomonas aeruginosa 19 h; recoveries of all the strains were more than 70%. The significance level indicated that there was no significant difference between two methods. The results showed that the fluorescence-based rapid detection method could be used in the microbial tests for water with advantages of greatly shortened culture period and accurate test result.
Key wordsprocess water; fluorescence staining; rapid detection of microorganism; membrane filtration method
作者简介:李培珏(1983~),女,硕士在读,工程师。E-mail:pelldgei@163.com。 *通讯作者: 侯晨晔(1986~),女,硕士,工程师。电话:021-38954600-3291,E-mail:cyhou@microport.com。