痺苓祛痛颗粒的UPLC指纹图谱研究

汪琛媛，李　瑛，汪永忠

(1.安徽中医药大学，安徽 合肥　230012；2.安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥　230031)

痺苓祛痛颗粒的UPLC指纹图谱研究

汪琛媛1,2，李瑛2，汪永忠1,2

(1.安徽中医药大学，安徽 合肥230012；2.安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥230031)

摘要：目的建立超高效液相色谱法(UPLC)研究痺苓祛痛颗粒指纹图谱，为其质量控制提供依据。 方法色谱柱为Acquity BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，流动相为乙腈-0.05%磷酸水溶液，梯度洗脱；流速为0.25 mL·min-1；检测波长为254 nm。结果建立了10批痺苓祛痛颗粒的共有图谱，相似度均大于0.97，确定了13个共有峰。结论所建立的痺苓祛痛颗粒的指纹图谱特征性和专属性强，该方法可用于痺苓祛痛颗粒的质量控制。

关键词：色谱法,高压液相;质量控制;痺苓祛痛颗粒

痺苓袪痛颗粒为安徽省中医院特色制剂，处方源于名老中医王正雨老先生的经验方，根据中医理论组方，处方由威灵仙、黄柏、当归、怀牛膝、虎杖、萆薢、泽泻、薏苡仁、苍术、土茯苓组成，诸药合用具有清热泄浊、解毒活血之功效，主要治疗痛风性关节炎急性期、间隙期，疗效较好[1]。目前，对于质量控制研究主要是应用高效液相色谱等方法对几种成分的含量进行测定，来评价其质量的优劣[2]，然而，从传统中医药理论的观点来看，仅从指标成分的含量控制还难以满足对中药质量的全面控制的要求[3]。由药材中单一或几个化合物来对一种或几种药材定性或定量标定是一种普遍现象，其控制的是中药中的某部分组分，忽略了中药中多种成分、多种机制的协同作用，难以全面衡量中药的疗效和质量[4]。HPLC法具有分析时间过长，变化较多等缺点[5-6]。超高效液相色谱(UPLC)的分析效率更高，可显著缩短分析时间，减少流动相的消耗；UPLC 可检测更微量的样品，色谱分离效果更好、灵敏度更高,洗脱条件比变化更简单，色谱峰的漂移时间较短，在指纹图谱软件中色谱峰易于匹配等优点[7]。参考文献[8-10]本文采用UPLC法对痺苓祛痛颗粒指纹图谱进行测定，可有效控制该制剂的质量。

1仪器与试药

Waters Acquity H-Class UPLC超高效液相色谱仪(美国Waters公司)，包括四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、PDA检测器、二极管阵列检测器以及Empower2色谱数据工作站；KQ3200DB型数控超声清洗器(江苏昆山超声仪器有限公司)；BP211D型电子天平(德国Sartorius)；大黄素对照品(中国药品生物制品检定研究院，批号110756-200110，供含量测定用)；乙腈为色谱纯(美国TEDIA公司)；甲醇、磷酸等试剂均为分析纯；蒸馏水(自制)。痺苓祛痛颗粒样品(批号20140323、20140420、20140511、20140622、20140705、20140815、20140910、20141002、20141112、20141224，分别以S1～S10表示)，由安徽中医药大学第一附属医院制剂中心生产。

2方法和结果

2.1色谱条件色谱柱：Acquity BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，柱温：26℃；流动相：乙腈,0.05 %磷酸水溶液，采用梯度洗脱(流动相梯度设置见表1)；流速为0.25 mL·min-1；检测波长：254 nm；进样量：1.0 μL。

表1　流动相梯度

2.2对照品溶液的制备精密称取大黄素对照品2.80 mg并置于5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，作为对照品溶液。

2.3供试品溶液的制备分别取痺苓祛痛颗粒样品适量，研细，称0.5 g置于10 mL容量瓶中，加100%甲醇定容，超声处理30 min(250 W，40 kHz)，放冷，甲醇补充至刻度，摇匀，取上清液滤过即为供试品溶液。

2.4方法学考察

2.4.1精密度试验取S1(批号为20140323)样品供试品溶液，照2.3项下处理供试品溶液，按2.1项下色谱条件连续进样6次，分别进样2 μL，以考察仪器精密度得到的色谱，其色谱图线能够很好的重合，经《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A版)计算，相似度均在0.98以上，结果见表2。

2.4.2稳定性试验以S2(20140420)样品供试品溶液，照2.3项下方法制备供试品，以2.1项下色谱条件连续进样6次，进样2 μL，分别在0、4、8、12、16、24 h进样，记录。经中药《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A版)评价，以考察仪器稳定性得到的色谱，其色谱图线能够很好的重合，结果相似度均在0.97以上，表明供试品溶液在24 h内稳定，结果见表3。

表2　痺苓祛痛颗粒指纹图谱的精密度图谱相似度

表3　痺苓祛痛颗粒指纹图谱的稳定性图谱相似度

2.4.3重复性试验以S6(20140815)供试品溶液按2.3项下方法制备，按2.1项下方法的色谱条件进样测定，经《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A版)评价，相似度均在0.97以上，结果见表4。

表4　重复性结果

2.5痺苓袪痛颗粒指纹图谱的建立与分析

2.5.1特征指纹图谱测定取10批痺苓袪痛颗粒制剂成品，按2.3项下方法制备供试品，在2.1项下的色谱条件进行检测，记录色谱峰，将获得各批样品色谱信息处理成AIA格式，导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A版)得到其共有模式图谱。共获得13个峰，其中11号峰为大黄素，共有模式图谱、大黄素对照品图谱和10批样品的叠加图谱的色谱见图1、图2。

2.5.2特征指纹图谱的结果分析对实验得出的10批痺苓袪痛颗粒的共有模式中的13个色谱峰的峰面积和出峰时间的平均值和RSD进行了计算，结果表明各共有峰保留时间RSD均小于2 %；13个共有峰的峰面积RSD值在2.18 %～4.94 %之间，痺苓袪痛颗粒质量较稳定，平均峰面积结果见表5。

表5　10批样品特征指纹图谱峰面积

表6　10批痺苓袪痛颗粒样品的特征指纹图谱相似度

图1痺苓袪痛颗粒对照品和共有模式的色谱图图210批痺苓袪痛颗粒的UPLC特征指纹叠加图谱

运用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A版)对10批次的样品指纹图谱进行相似度评价。选定色谱图中13个色谱峰作为特征峰，进行谱图匹配，其中11号峰大黄素与相邻峰分离度较好，且峰面积较适中，因此选定其为参比峰。通过指纹图谱相似度软件，对10批样品进行整体相似度评价，结果显示这10批次的样品相似度大于0.97，说明10批制剂整体工艺稳定，质量较均一，UPLC特征指纹图谱可作为质量控制方法。结果见表6。

3讨论

比较了不同比例的甲醇—水(甲醇体积分数分别为0、50%、100%)溶剂对样品的提取率，结果显示，100%甲醇的提取率略高于其他溶剂。由于等度洗脱分离效果较差，使用乙腈—0.05 %磷酸水溶液进行了不同的梯度洗脱优化，结果显示图谱指纹性强，且各色谱峰大部分都得到了基线分离。采用DAD检测器做全波长扫描，考察不同吸收波长图谱，结果表明，254 nm处各成分具有较好的紫外吸收，色谱信息丰富，基线平稳，而且避免了溶剂末端吸收的影响。

对10批制剂进行UPLC的指纹图谱研究，优选出最佳色谱峰条件，建立了不同批次制剂的共有模式，并进行了相似度评价。经过提高后建立的质量控制方法简单易行、专属性强、重现性好，能有效全面的控制该药品的质量。

参考文献

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[2]李瑛,吴小明,汪永忠,等.UPLC法同时测定痺苓祛痛颗粒中常春藤皂苷元和齐墩果酸含量[J].安徽医学,2015,36(3):259-261.

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[6]仲达,王艳.山茱萸醇提物HPLC指纹图谱及其聚类分析[J].安徽医药,2015,19(11):2077-2079.

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UPLC fingerprint of bilingqutong granule

WANG Chen-yuan1,2,LI Ying2,WANG Yong-zhong1,2

(1.AnhuiUniversityofChineseMedicine，Hefei,Anhui230012;2.TheFirstAffiliatedHospital,AnhuiUniversityofChineseMedicine，Hefei,Anhui230031,China)

Abstract:Objective To establish an ultra high performance liquid chromatographic (UPLC) fingerprint for the quality control of bilingqutong granule，to provide a comprehensive evaluation for its quality control.Methods UPLC separation was performed on an Acquity BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm) by gradient elution with 0.05 % phosphoric acid-acetonitrile as mobile phase.The flow rate was 0.25 mL·min-1and the detection wavelength was set at 254 nm.Results Thirteen characteristic common peaks of chemical constituents were identified and 10 batches of bilingqutong granule were analyzed.The quanlity of samples was assessed by Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM (2004 A version).The similarities of 10 batches of bilingqutong granule were all over 0.97,and 13 characteristic peaks of UPLC fingerprint for bilingqutong granule were established.Conclusions The established UPLC fingerprint of bilingqutong granule is convenient and highly specific,which could be used to identify and evaluate the quality of bilingqutong granule.

Key words:Chromatography,High Pressure Liquid;Quality Control;bilingqutong granul

基金项目:安徽中医药大学临床科学研究基金项目( No 2012LC1-016B)

通信作者:汪永忠，男，主任药师，硕士生导师，研究方向：中药新药研发，E-mail: wyzhmail@163.com

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.05.013

(收稿日期：2015-12-07,修回日期：2016-03-13)