云南部分兰科植物多糖的提取及含量测定

赵会然，王玉珍，许瑞岚，宗莉莉，胡　军，郭　洁

（大理大学药学与化学学院，云南大理　671000）



云南部分兰科植物多糖的提取及含量测定

赵会然，王玉珍，许瑞岚，宗莉莉，胡军，郭洁*

（大理大学药学与化学学院，云南大理671000）

［摘要］目的：建立云南部分兰科植物多糖含量测定的方法，并对其提取工艺进行研究。方法：采用传统水提取方法提取多糖，以葡萄糖为标准品，用苯酚-硫酸法测定多糖的含量，并以其为考察指标，采用提取条件的优化筛选最佳提取工艺。结果：葡萄糖在0.000～0.020 mg/mL范围内线性关系良好，线性回归方程为A=55.55c（mg/mL）+ 0.001（r=0.999 8），平均加标回收率为99.7%，RSD=3.13%（n=6）；最佳显色条件：苯酚用量1.0 mL、浓硫酸用量7.0 mL、显色温度80℃、显色时间30 min；提取兰科植物多糖的最佳工艺条件为：提取温度70℃，料液比1：40，提取时间2 h。结论：该方法简便、准确，优选出的提取工艺重复性好。

［关键词］兰科植物；多糖；提取条件；含量测定；苯酚-硫酸法

［DOI］10. 3969 / j. issn. 2096-2266. 2016. 04. 007

兰科（Orchidaceac）约700属，20 000～35 000种〔1〕，主要分布在热带地区〔2〕。中国有194属，1 388种，而云南、台湾和海南岛居多，其中云南目前有151属，709种〔3〕，在各省区中居第1位，故有“植物王国”的美誉。兰科植物中的石斛、天麻、白芨、芋兰、杜鹃兰等是重要的中药材。石斛的主要药用成分为多糖和生物碱等〔4〕，而植物多糖因有增强和调节机体免疫功能，抗衰老，抗肿瘤，抗辐射等作用而受到广泛的重视〔5-6〕。石斛混淆品众多，包括石斛属外的金石斛属、石仙桃属、石豆兰属和贝母兰属等植物〔7〕，但其药用物质基础尚不明确，不利于这些药用植物的深度开发或质量标准的建立，有必要对其物质基础进行深入的研究。

经过查阅文献资料，筛选出部分云南产兰科植物作为研究对象，对这些植物中多糖含量的研究尚未见报道。本文用苯酚-硫酸法〔8〕对这些石斛混淆品的多糖含量进行测定，为进一步开发和利用兰科植物提供参考依据。

1　材料与方法

1.1仪器RE-5203旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；AL204电子天平（梅特勒—托利多仪器上海有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；SZCL-2数显智能控温磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）；TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；FW100型高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）。

1.2试剂无水乙醇、葡萄糖、苯酚、浓硫酸，以上试剂均为分析纯。

葡萄糖标准溶液的配制：准确称取105℃干燥至恒重的葡萄糖250.0 mg，以适量蒸馏水溶解并转移至250 mL容量瓶，用蒸馏水定容至刻度，即得浓度为1 mg/mL的葡萄糖标准储备液。取5 mL浓度为1 mg/mL葡萄糖溶液至50 mL容量瓶，用蒸馏水定容至刻度，即得浓度为0.1 mg/mL的葡萄糖标准溶液，备用。

5%苯酚溶液的配制：在40℃的温度下，溶解部分苯酚，再向溶解的苯酚中加入0.1 g铝片进行常压蒸馏，收集182℃馏分。称取苯酚馏分5.0 g，用适量蒸馏水溶解，转移至100 mL容量瓶，用蒸馏水定容至刻度，然后将其转移至100 mL棕色瓶中，即得5%苯酚溶液，备用。

1.3样品兰科植物：滇西贝母兰Coelogynecalcicola；喉红石斛Dendrobium christyanum；密花毛兰Eriaspicata；镰翅羊耳蒜Liparis bootanensis；温氏卷瓣兰Bulbophyllum wendlandianum。把各株植被分开，再单独烘干，粉碎，过孔径0.30 mm筛，备用。以上样品均采购于云南大理三月街药材市场，由昆明植物研究所胡江苗副研究员鉴定。

样品溶液的配制：分别准确称取5.000 0 g样品粉末，置于圆底烧瓶中，依次加入200 mL蒸馏水，在70℃的水浴中加热提取1 h，重复提取2次，合并提取液并浓缩至20 mL左右，冷却至室温后加入3倍体积的95%乙醇，摇匀，在4℃下放置12 h，抽滤，风干得粗多糖。称取粗多糖0.025 0 g，用水溶解并定容于50 mL容量瓶中，即得样品溶液。

1.4方法分别取适量试液和空白液置于干燥的具塞比色管中，加蒸馏水至2.0 mL，然后加入5%苯酚溶液1.0 mL，将试管放入冰水中，沿试管壁缓慢加入浓H2SO47.0 mL，待冷却后，在冰水中摇匀。然后放入80℃水浴中加热30 min，流水冷却至室温。在选定波长下，以试剂空白为参比，测定试液的吸光度。

1.5实验条件的选择

1.5.1测定波长的选择取适量葡萄糖标准溶液、滇西贝母兰提取液、蒸馏水，按实验方法显色后，以蒸馏水为参比，在400～600 nm波长内分别测绘3种溶液的吸收曲线。见图1。结果表明，葡萄糖和样品提取液均在488 nm处有最大吸收。因此以488 nm作为测定波长。

图1　吸收曲线

1.5.2试剂用量、显色温度、显色时间的选择分别考察了苯酚用量、浓H2SO4用量、显色温度和显色时间对测定结果的影响。在选定波长下测定试液吸光度。实验结果表明：5%苯酚溶液用量在0.9～1.0 mL、浓H2SO4用量在6.5～7.5 mL、显色温度在60～90℃、显色时间在10～50 min范围内，测定体系的吸光度较大且基本不变，所以确定5%苯酚用量为1.0 mL、浓H2SO4用量为7.0 mL、显色温度为70℃、显色时间为30 min作为最佳测定条件。

1.5.3精密度和稳定性实验移取样品溶液1.0 mL，分别置于6个10 mL具塞比色管中，按实验方法显色后，测定吸光度，计算RSD=2.00%（n=6）。实验表明，在选定的测定条件下，测定体系在室温下至少稳定2 h。

2　结果

2.1标准曲线的绘制分别取葡萄糖标准溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL至干燥的具塞比色管中，按实验方法、在选定实验条件下测定试液的吸光度并测绘制标准曲线。结果表明，在葡萄糖含量为0.000～0.020 mg/mL范围内，试液的吸光度与葡萄糖浓度有良好的线性关系，线性回归方程为A=55.55c（mg/mL）-0.001，相关系数r= 0.999 8。

2.2样品溶液多糖含量的测定移取1.0 mL样品溶液，按实验方法、在选定条件下显色后测定吸光度，从标准曲线方程中计算多糖的含量，平行测定6次，取平均值。见表1。

表1　样品中多糖含量测定结果（n=6）

由表1可知，不同样品中多糖的含量有差异，其中滇西贝母兰的多糖含量最高，镰翅羊耳蒜的多糖含量最低。

2.3加标回收实验移取适量样品溶液，分别加入0.02、0.08 mg葡萄糖，进行回收率测定（n=6）。平均回收率为99.7%，RSD=3.13%。结果表明该实验方法准确度高。见表2。

2.4样品中多糖提取条件的优化

2.4.1粗多糖的提取流程样品粉末→加适量水后加热提取→抽滤→合并提取液→浓缩→加入适量95%乙醇在4℃下醇沉12 h→抽滤→风干→称重。

2.4.2提取条件的优化考察提取温度、提取时间、料液比、提取次数对提取率的影响，实验结果表明，提取率随提取温度、提取时间、料液比、提取次数的增加均有所增加，当温度增加到70℃后，提取率稍有下降；提取时间增加到2 h后、料液比增大到1：40以上、提取次数增加到2次以上，提取率基本不变。因此选定提取温度为70℃，提取时间为2 h，料液比为1：40，为节约时间及降低能耗，选择提取次数为2次。

表2　加标回收实验结果

在选定的提取条件下，分别对不同样品进行3次平行提取，计算提取率。见表3。

表3　样品提取率测定结果（n=3）

3　讨论

本实验通过水提醇沉法提取多糖，并优化了提取条件，方法简便、准确，使样品中的多糖提取较为完全，保障了后续测定结果准确可靠。实验采用苯酚-硫酸比色法测定多糖的含量，由精密度实验、稳定性实验和加标回收实验结果表明，方法的精密度、准确度较高，稳定性好，可作为兰科植物多糖含量测定方法。在实验过程中发现试液显色的起始温度不一致会对测定结果有影响，我们采取在冰水浴中缓慢加入浓硫酸，并在冰水浴中将试液摇匀，保证了显色起始温度不受浓硫酸稀释时放热的影响，使显色起始温度一致，从而使样品测定结果更准确。

［参考文献］

〔1〕张殷波，杜昊东，金效华，等.中国野生兰科植物物种多样性与地理分布〔J〕.科学通报，2015，60（2）：179-188.

〔2〕杨鸿培，余东莉.云南兰科植物新资料〔J〕.亚热带植物学，2013，42（4）：350-352.

〔3〕金伟涛，向小果，金效华.中国兰科植物属的界定：现状与展望〔J〕.生物多样性，2015，23（2）：237-242.

〔4〕王建，陶靖，莫莹，等.广西不同产地马鞭石斛多糖含量的测定〔J〕.广西中医药大学学报，2013，16（2）：78-80.

〔5〕刘莉，萧风回.石斛属药用植物多糖研究进展〔J〕.现代中药研究与实践，2009，23（1）：77-80.

〔6〕余刚.多糖及石斛多糖研究综述〔J〕.大众体育，2013 （66）：148-149.

〔7〕陈业高，徐桃苹，武荷云.贝母兰属植物化学成分及药理活性研究进展〔J〕.时珍国医国药，2006，17（3）：338-339.

〔8〕周跃斌，王伟，周向荣，等.苯酚-硫酸比色法测定毛竹叶多糖的研究〔J〕.现代食品科技，2008，24（2）：180-183.

（责任编辑毛本勇）

Extraction of Polysaccharide and Content Determination of Yunnan Orchidaceae Plants

Zhao Huiran，Wang Yuzhen，Xu Ruilan，Zong Lili，Hu Jun，Guo Jie*
（College of Pharmacy and Chemistry，Dali University，Dali，Yunnan 671000，China）

〔Abstract〕Objective: To establish the method for determining the contents of polysaccharides and to explore the extraction technique for polysaccharides from Yunnan orchidaceae plants. Methods: The polysaccharide was extracted with the traditional water extraction，using glucose as the standard，and the contents of polysaccharides was measured by the phenol-sulfuric acid method. With the content of polysaccharides as an index，the univariate test were performed to find the optimal extraction technique. Results: A good linear relationship with a regression equation of A=55.55c（mg/mL）+0.001（r=0.999 8）was achieved when the concentration of glucose ranged between 0.000 and 0.020 mg/mL. The average recovery rate was 99.7%，and the relative standard deviation was 3.13%（n=6）. The best conditions of color are as follows，the dosage of phenol and sulphuric acid was 1.0 mL and 7.0 mL respectively，temperature of color was at 80℃，and developing time was 30 minutes. The optimal extraction of polysaccharide was performed by 2 hours soaking using 1 : 40 volumes of solvent at 70℃. Conclusion: The established method is simple and accurate and the optimal extraction technique shows good reproducibility.

〔Key words〕Orchidaceae plants；polysaccharide；extraction conditions；determination of content；phenol sulfuric acid method

［中图分类号］R284.2

［文献标志码］A

［文章编号］2096-2266（2016）04-0026-03

［基金项目］国家自然科学基金资助项目（81160393）；大理大学大学生科研基金资助项目（yh201404）

［收稿日期］2016-01-09［修回日期］2016-03-14

［作者简介］赵会然，硕士研究生，主要从事天然药物化学研究.

*通信作者：郭洁，教授.