人核糖核酸酶抑制因子siRNA慢病毒载体的构建及鉴定

丁 宁，邱景剑，王定友，李劭恒，张 云，李 坤

（大连大学 医学院，辽宁 大连 116622）

人核糖核酸酶抑制因子siRNA慢病毒载体的构建及鉴定

丁 宁，邱景剑，王定友，李劭恒，张 云，李 坤

（大连大学 医学院，辽宁 大连 116622）

本实验旨在构建人核糖核酸酶抑制因子稳定干涉载体pLKO.1-dsRI，为后续观测人核糖核酸酶抑制因子干涉载体的表达对肿瘤细胞的影响奠定基础。用亚克隆法,将针对人核糖核酸酶抑制因子的干涉片段从 Simple T-dsRI质粒克隆到pLK-0.1-TRC质粒,用酶切法筛选得到阳性重组质粒pLKO.1-dsRI，用测序法鉴定克隆序列正确。转染时设干扰组、空载体组和空白组三组，每组三次重复。用脂质体CellfectinR将pLKO.1-dsRI（干扰组）、pLKO.1-TRC（空载体组）转染进人肝癌细胞HepG2细胞中，未处理的细胞作空白组。转染后72hr用Western blotting检测细胞中核糖核酸酶抑制因子表达的变化。双酶切鉴定及测序鉴定结果均正确；Western blotting结果表明，对比空白组（1.1578±0.015）和空载体组（1.1216±0.027），干扰组RI表达（0.6119±0.048）明显下调（P<0.05）。结果表明人核糖核酸酶抑制因子干涉载体pLKO.1-dsRNH1构建成功。

人核糖核酸酶抑制因子；siRNA；慢病毒载体

人核糖核酸酶抑制因子（human ribonuclease inhibitor，hRI）是一种广泛存在于细胞的可溶性酸性糖蛋白，分子量为50kD，能紧密结合血管形成因子（Angionenin,Ang）[1,2]。已有实验证实，RI可能有效地抑制肿瘤诱导血管生成[3,4]。因此人们推测hRI可能为抗肿瘤血管活性的抑制基因，有望应用于肿瘤的基因治疗中。以往的工作将靶向RI基因构建于逆转录病毒载体上，但是该载体在分裂不活跃的细胞中如神经元细胞中的转染效率较低，因而本研究构建了RNA干扰人RI基因的慢病毒载体，旨在利用RNAi技术沉默分裂不活跃的细胞中的RI基因，为下一步深入研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

慢转录病毒表达载体pLKO.1-TRC（图1）、E.coli DH5α由大连大学医学院生物化学与分子生物学教研室保存；针对人核糖核酸酶抑制因子siRNA表达载体Simple T-dsRI由大连Takara生物公司构建[3]。限制性内切酶EcoR1、DNA Marker、T4DNA连接酶购自TaKaRa；限制性内切酶Age1购自NEB；DNA快速凝胶产物回收试剂盒购自博大泰克公司；琼脂糖、氨苄青霉素和链霉素购自华美生物公司；LB培养基购自Invitrogen/GIBCO。

图1 pLKO.1质粒图谱

1.2 方法

1.2.1 重组载体pLK0.1-dsRI的的构建、鉴定及测序

质粒 pLK0.1-TRC经 Agel单酶切、Klenow Fragment和dNTP补平后，用乙醇沉淀法回收得到约7.1 kb的pLKO.1-TRC的线性大片段，再用EcoRⅠ酶切，经琼脂糖电泳回收，得到约7 kb的一端平头、一端黏性的线性载体大片段。针对人核糖核酸酶抑制因子的siRNA表达载体Simple T-dsRI质粒用SmaⅠ和EcoRⅠ双酶切后，经2%琼脂糖电泳回收，获得约84bp目的片断（dsRI）。将线性载体片段与目的片段用T4DNA连接酶连接、转化，涂布于氨苄青霉素抗性平板，挑取单菌落，提取质粒，用EcoRⅠ和NcoⅠ进行双酶切pLK0.1-dsRI，筛选得到正向连接的阳性克隆。

1.2.2 HepG2细胞培养和转染

细胞在含100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素和10%FBS的DMEM培养基中，37℃、5%CO2条件下培养。按4×104个/孔将细胞铺板于24孔板，至60%～70%汇片时，按CellfectinR说明书转染，分为3组：正常细胞组（空白组）、pLKO.1-dsRI（干扰组）、pLKO.1-TRC（空载体组），2个平行复孔。每组质粒共用0.8µg、脂质体2µL。转染后24 h，换成完全培养基培养72 hrs后收获。

1.2.3 Western blotting检测核糖核酸酶抑制因子的表达

各组取60 μg总蛋白经12%SDS-PAGE电泳、转膜，用5%脱脂奶粉4℃封闭过夜、RI一抗（1:1000稀释）过夜，然后再用HRP标记的二抗IgG（1:2000稀释）室温反应1～2 h。用ECL发光试剂盒反应液发光。曝光时间30 s～5 min。由Bio-Rad凝胶成像仪摄取凝胶图像，用Image LAbTM软件进行定量分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS 11.5统计软件分析，实验数据以均数±标准差表示采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。

2 结果

2.1 重组载体pLK0.1-dsRI的构建

质粒dsRI-T Simple为本实验室以往构建的克隆载体，长约3042 bp，经SmaⅠ和EcoRⅠ双酶切后，得到约 2.7 Kb和 84 bp两条带（图 2）。质粒pLK0.1-TRC经Agel单酶切和Klenow Fragment和dNTP补平后，获得约8.9 kb的线性载体大片段（图2）；再用EcoRⅠ单酶切后，得到7 Kb和2 Kb两条带（图3），然后切胶回收7 Kb条带（图4）。

图2 质粒pKD-dsRI-T Simple的双酶切和质粒pLKO.1-TRC用AgeⅠ单酶切/Klenow补平电泳图

图3 EocRⅠ酶切经Klenow补平的pLKO.1-TRCF片段凝胶电泳图

图4 回收约7 kb的片段凝胶电泳图

2.2 质粒酶切鉴定

质粒pLK0.1-dsRI分别用EcoRⅠ和NcoⅠ酶切后，琼脂糖凝胶电泳检测到大小约为5000 bp和1900 bp两条片段，与预期结果符合，表明酶切正确（见图5）。

图5 质粒pLKO.1-dsRI双酶切凝胶电泳图

2.3 Western blotting检测核糖核酸酶抑制因子的表达

Western blotting显示，与空白组和空载体组对比，干扰组中hri基因被显著下调（P<0.05），抑制率大于60%：空白组的相对表达强度为1.1578±0.015，空载体的相对表达强度为1.1216±0.027，干扰组的相对表达强度为0.6119±0.048。可见，hri基因在蛋白水平上被沉默（见图6）。

图6 Western blotting检测HepG2细胞中hRI的表达

3 讨论

人核糖核酸酶抑制因子是体内重要的蛋白质。其一级结构富含亮氨酸和大量的游离巯基[9]，空间结构由富含亮氨酸残基重复区（Leucin-rich reapeat，LRR）的α/β螺旋折叠结构重复多次形成的弯曲的马蹄形结构。而含有这样重复顺序的一百多种蛋白质显示了广泛的功能，包括细胞周期调节、DNA修复、细胞外基质的相互作用等。且游离巯基是RI保持活性的必要因素[10-13]。因此，RI功能是多方面的。

本研究旨在成功构建人核糖核酸酶抑制因子干涉载体pLKO.1-dsRI。本研究所选载体为一种慢病毒表达载体，其优点是能够感染多种难感染的细胞，比如原代细胞，干细胞，神经元细胞等，有利于后续实验检测。而且慢病毒能够将外源基因插入细胞基因组内，既可转染分裂期活跃的细胞，也可转染分裂缓慢或处于分裂终末期的细胞[14,15]，实现稳定转染。对构建的质粒进行PCR检测，结果显示产物都位于约192 bp之间，与预期结果相符；再用EcoRⅠ和NcoⅠ对质粒进行双酶切，电泳条带显示：一条在2 kb，另一条在5 kb，与理论值相符；同时将质粒送宝生物测序，各项结果共同显示慢病毒pLKO.1-dsRI载体构建成功。

本研究成功构建了人核糖核酸酶抑制因子干涉载体pLKO.1-dsRI，其能在肿瘤细胞中稳定地表达，这为后续观测人核糖核酸酶抑制因子干涉载体的表达对肿瘤细胞的影响奠定了基础。

[1]潘东宁,傅攀峰,王红,等.核糖核酸酶抑制因子对H2O2损伤的大鼠神经胶质瘤细胞系C6的影响[J].中国生物化学与分子生物学报,2002,18(6):767-771.

[2]Castillo-Martin M,Domingo-Domenech J,Karni-Schmidt O,et al.Molecular pathways of urothelial development and bladder tumorigenesis[J].Urol Oncol,2010,28(4):401-408．

[3]李坤,田余祥,陈海波,等.重组人核糖核酸酶抑制因子基因的siRNA表达载体构建及B16细胞中基因沉默的鉴定[J].应用与环境生物学报,2007,13(4):519-522.

[4]Shapiro R.Cytoplasmic ribonuclease inhibitor[J].Methods Enzymol,2001,341:611-628.

[5]Wang T,Yang M,Chen J,et al.Inhibition of B16 melanoma growth in vivo by retroviralvector-mediated human ribonuclease inhibitor[J].Angiogenesis,2005,8(1):73-81．

[6]Fu P,Chen J,Tian Y,et al.Antitumor effect of hematopoieticcell scarring the ribonuclease inhibitor[J].Cancer Gene Ther,2005,12(3):268-275．

[7]盛甫秀,樊建慧,王冬梅,等.分泌性表达载体V-Plncx–shri对小鼠B16黑色素瘤生长的抑制作用[J].癌症,2009,28(3):236-243.

[8]Lin Lia,Xiang-Yang Pana,Jing Shua.Ribonuclease inhibitor up-regulation hibits the growth and induces apoptosis in murine melanoma cells through repression of angiogenin and ILK/PI3K/AKT signaling pathway[J].Biochimie,2014,103:89-100.

[9]刘苏虎,张镁,张王刚.在哺乳动物细胞中用于表达干扰RNA的启动子[J].医学分子生物学杂志,2004,1(3):175-177.

[10]Franceschini IA,Feigenbaum-Lacombe V,Casanova P,et al.Efficient Gene transfer in mouse neural precursors with abicistronic retroviral vector[J].J Neurosci Res,2001,65(3):208-219.

[11]Zhang J,Liu W,Liu J,et al.G-protein β2 subunit inter-acts with mitofusin 1 to regulate mitochondrial fusion[J].Nat Commun,2010(1):101.

[12]尹志华,任彩萍,李峰,等.利用报道基因检测鼻咽癌细胞的RNA干扰作用[J].癌症,2005,24(3):371-375.

[13]尹昌林,吕胜青,黄轶,等.pSiRNA-Notch1逆转录病毒载体的构建及对恶性脑胶质瘤细胞的作用[J].第三军医大学学报,2007,29(12):1211-1214.

[14]Xia H,Mao Q,Paulson H,et al.siRNA-mediated gene si-lencing in vitro and in vitro[J].Nat Biotechnol,2002,20:1006-1010.

[15]J unxia Chen,Xiou-Yang,Juan Gao.Knockdown of ribonuclease inhibitor Expression with siRNA in noninvasive bladder cancer cell line BIU-87 promotes growth and metastasis potentials[J].Molecular and Cellular Biochemistry,2011,349(1-2):83-95.

Construction and Identification of Human Ribonuclease Inhibitor siRNA Lentiviral Vector

DING Ning,QIU Jing-jian,WANG Ding-you,LI Shao-heng,ZHANG Yun,LI Kun
(College of Medicine,Dalian University,Dalian 116622,China)

To construct the interference expression vector of human ribonuclease inhibitor pLKO.1-dsRI which express in tumor cells can lay the foundation for the subsequent observations.The purpose fragments of dsRI from the plasmid of Simple T-dsRI was subcloned into the lentiviral vector of pLKO.1-TRC.The vector was identified by enzyme digested.And then the shRNA-RI lentiviral vector of pLKO.1-dsRNH1 transfected into HepG2 cells with CellfectinR,using the cells transfected with empty vector of pLKO.1-TRC as blank groups and those untransfected cells as controls.After72hrs,the silencing effect of the siRNA plasmid was identified by Western blotting on the HepG2 cells.Restriction enzyme digestion proved that the construction of the retroviral vector expressing shRNA targeting hRI gene was correct.Western blotting showed that the expression of hRI were significantly reduced in the cells transfected with shRNA-hRI retroviral vector as compared with the blank and the empty vector group,and the ratio value of hri/β-actin is 0.6119±0.048 vs 1.1578±0.015,1.1216±0.027（P<0.05）.The human ribonuclease inhibitor interference vector pLKO.1-dsRI was constructed successfully.

Human ribonuclease inhibitor;siRNA;lentiviral vector

Q782

：A

：1008-2395(2016)06-0062-04

2016-10-31

大连大学本科生创新课题（2015125）；大连大学本科生创新课题。

丁宁(1977-)，女，实验师，研究方向：肿瘤分子生物学。