利拉鲁肽对2型糖尿病大鼠降血压、利水盐的作用机制探讨

王少清，毛楠，周萍，汪力△，高芳，卫怡勋，樊均明，付平

利拉鲁肽对2型糖尿病大鼠降血压、利水盐的作用机制探讨

王少清1，毛楠1，周萍1，汪力1△，高芳1，卫怡勋1，樊均明2，付平3

摘要：目的通过观察胰高血糖素样肽-1（GLP-1）类似物利拉鲁肽对2型糖尿病大鼠肾脏内髓一氧化氮合酶（NOS）、环加氧酶2（COX2）表达的影响，探讨利拉鲁肽降血压和利水盐的作用机制。方法30只雄性SD大鼠给予高糖高脂饲料喂养，自由摄水，8周后空腹注射链脲佐菌素（STZ），成功建立2型糖尿病大鼠模型18只，选取12只随机分为利拉鲁肽处理2型糖尿病模型（DMT）组和2型糖尿病模型（DM）组，另取12只正常大鼠随机分为利拉鲁肽处理野生型大鼠（WTT）组和野生型大鼠对照（WT）组，每组6只。DMT和WTT组每天予以利拉鲁肽（200 μg/kg体质量）皮下注射，DM和WT组每天予以等量生理盐水皮下注射，各组分别在给药后0、2、4、6周检测血糖和血压，给药后6周收集尿液检测K、Na、Cl离子浓度，然后处死大鼠，收集血液检测血K、Na、Cl离子浓度，取肾组织通过Real-time PCR和Western blot检测肾脏内髓NOS和COX2的mRNA和蛋白表达水平。结果利拉鲁肽干预后，DMT组大鼠血糖（F=5.933，P<0.05）及血压（F=22.070，P<0.05）随时间变化逐渐降低。在干预6周后，DMT组大鼠血糖（mmol/ L：12.78±3.82 vs.18.75±1.68）和血压（mmHg：119.98±4.43 vs.136.42±4.48）较DM组均明显降低（P<0.05），血液中K、Na、Cl离子浓度与DM组相比无明显差异，但尿液中K（mmol/L：46.55±6.43 vs.33.13±9.71）、Na（mmol/L：56.33±8.83 vs.41.20±7.25）、Cl（mmol/L：159.81±25.06 vs.71.44±12.99）离子浓度高于DM组大鼠（P<0.05），且肾脏内髓NOS、COX2的mRNA和蛋白表达均高于DM组大鼠（P<0.05）。结论利拉鲁肽可能通过NOS诱导COX2的表达增强，发挥利水盐、降血压的作用。

关键词：胰高血糖素样肽-1；利拉鲁肽；肾脏内髓；糖尿病，2型；一氧化氮合酶；环加氧酶2

基金项目：四川省教育厅2013年科研资助重点项目（13ZA0213）；四川省卫生厅2013年科研资助项目（130386）；成都医学院驼鸟计划2012年专项基金资助项目（CYX12-024）；2014校级大学生创新实验计划项目（CXXS201422）

作者单位：1成都医学院第一附属医院肾病科（邮编610500）；2西南医科大学附属中医院肾脏内科；3四川大学华西医院肾脏内科

作者简介：王少清（1976），男，副主任医师，副教授，博士，主要从事慢性病肾损害机制及干预研究

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通讯作者E-mail：93331524@qq.com

胰高血糖素样肽-1（GLP-1）由胃肠道内的L细胞分泌，是一种重要的肠促胰岛素，其类似物是目前临床上治疗2型糖尿病的一类新药。研究证实，GLP-1除了具有降血糖、降体质量的作用外，还具有降脂、降血压和调节水盐代谢等心肾保护功能［1-3］，但具体作用机制尚不明确。多项研究发现，GLP-1扩张血管的作用与一氧化氮（NO）有关［4-6］。肾脏内髓作为肾脏重要的功能区域，其间质压力可调节肾小管水、钠重吸收，是肾脏产生压力性利尿的基础，也是参与系统血压调节的重要机制［7］。肾脏内髓的环加氧酶2（COX2）与水盐代谢和血压调节有关，NO参与了其调节过程［8-10］。因此，笔者推测GLP-1可能通过一氧化氮合酶（NOS）而诱导COX2表达，发挥调节水盐和降血压的作用。本实验通过检测GLP-1类似物利拉鲁肽对2型糖尿病大鼠肾脏内髓NOS和COX2表达的影响，探讨利拉鲁肽调节2型糖尿病大鼠肾脏水盐和降血压的作用机制。

1　材料与方法

1.1实验材料及仪器清洁级雄性SD大鼠50只，体质量（230±20）g，购于成都达硕生物科技有限公司，自由摄食摄水，除实验应激外无其他不良刺激。高糖高脂饲料（10%猪油，20%糖，10%蛋白粉，1%胆固醇，59%基础饲料）由重庆腾鑫生物科技有限公司生产。链脲佐菌素（STZ），美国Sigma；利拉鲁肽，丹麦诺和诺德公司；NOS和COX2抗体，Bioworld公司。无创尾动脉血压测量系统购于安徽正华生物仪器设备有限公司。

1.2方法

1.2.12型糖尿病大鼠模型的建立30只大鼠适应性饲养1周，给予高糖高脂饲料喂养，自由摄水。8周后，空腹注射STZ（溶于0.1 mmol/L的柠檬酸缓冲液，pH 4.4，注射剂量：35 mg/kg），5 d后检测空腹血糖，共18只大鼠血糖值≥16.7 mmol/L，确定2型糖尿病大鼠造模成功。

1.2.2动物分组及药物处理取12只2型糖尿病大鼠，随机分为2组：利拉鲁肽处理2型糖尿病模型（DMT）组和2型糖尿病模型（DM）组，另取正常大鼠12只，随机分为利拉鲁肽处理野生型大鼠（WTT）组和野生型对照（WT）组，每组6只。DMT组和WTT组每天皮下注射利拉鲁肽（200 μg/kg），DM组和WT组每天皮下注射等量生理盐水。

1.2.3数据与标本采集药物处理的0、2、4、6周，分别测量各组大鼠的血糖和血压。第6周时采集24 h尿液样本后处死大鼠，并取血液及肾脏组织标本，血液和尿液样本用日立7170A全自动生化分析仪检测K、Na、Cl离子浓度，肾组织标本冻存于液氮中以备后续试验。

1.2.4大鼠血糖及血压检测血糖检测：采用强生全自动血糖仪检测。血压检测：将大鼠置于固定器内5 min，同时加热大鼠尾部，待其安静后将感应器放入加压气囊内并套在大鼠尾巴接近尾根的1/3处，并调整感应器位置直至获得稳定清晰的脉搏图像，向加压气囊内施加压力，观察并记录加压后出现的第1个波峰所处的血压值。

1.2.5Real-time PCR检测NOS和COX2的mRNA水平引物由上海生物工程有限公司合成。NOS引物序列：上游5′-GACCGATTACACGACATTGAG-3′，下游5′-TCTTAGGGCT⁃GCCAGGAT-3′，产物大小178 bp；COX2引物序列：上游5′-ACGGACTTGCTCACTTTG-3′，下游 5′-AGCGTTTGCGG⁃TACTCAT-3′，产物大小159 bp；内参GAPDH引物序列：上游5′-TCCCTCAAGATrGTCAGCAA-3′，下游5′-AGATCCA⁃CAACCGGATACATF-3′，产物大小308 bp。按照标准方法提取总mRNA，实施逆转录，并进行Real-time PCR反应和熔解曲线分析，计算NOS和COX2的mRNA水平。

1.2.6Western blot检测NOS和COX2的蛋白表达水平取大鼠肾脏髓质加入RIPA裂解液，4℃下匀浆提取总蛋白，BCA法测浓度，每孔蛋白上样总量为20 μg，十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后湿转印至PVDF膜上，Gel-Pro analyzer 4.0软件对得到的图像进行条带灰度分析，计算目的蛋白NOS、COX2与内参GAPDH的灰度比值。

1.3统计学方法采用SPSS 19.0进行数据的统计分析，计量数据以±s表示，行方差齐性检验及重复测量资料F检验，进一步两两比较用SNK-q法，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1利拉鲁肽处理对血糖及血压的影响DMT组在给予利拉鲁肽处理0～6周时，血糖逐渐下降（F= 5.933，P<0.05），处理6周后的血糖明显低于0周（P<0.05）；而DM、WTT和WT组的血糖没有随时间变化而发生明显变化（F分别为2.969、0.880、1.963，P>0.05）。相同时间点不同组间的血糖比较，6周时，4组的血糖差异明显（F=28.143，P< 0.05），其中DM组高于其他3组（P<0.05），见图1。血压的变化趋势与血糖基本一致，即利拉鲁肽处理DMT组0～6周时，血压出现逐渐下降（F=22.070，P<0.05），处理4周和6周后的血压明显低于0周（P<0.05）；而DM、WTT和WT组则在处理0～6周时，各时间点间的差异不明显（F分别为2.934、0.358、0.370，P>0.05）。相同时间点不同组间的血压比较，6周时，4组的血压差异明显（F=39.252，P< 0.05），其中DM组高于其他3组（P<0.05），见图2。

a与DMT组0周时比较，b与DM组6周时比较，P<0.05Fig.1　Changes of blood glucose levels after treating with liraglutide for 0-6 weeks图1　利拉鲁肽处理不同时间后对血糖的影响

a与DMT组0周时比较，b与 DM组 6周时比较，P<0.05；1 mmHg=0.133 kPaFig.2　Changes of blood pressure levels after treating with liraglutide for 0-6 weeks图2　利拉鲁肽处理不同时间后对血压的影响

2.2利拉鲁肽处理后对血液和尿液离子浓度的影响各组血液中的K、Na、Cl离子浓度并差异无统计学意义（F分别为1.786、3.609、2.113，P>0.05），见图3；而尿液中的K、Na、Cl离子浓度差异有统计学意义（F分别为 19.323、31.561、158.174，P< 0.05），DMT组高于DM组（P<0.05），其他3组间比较差异无统计学意义（P>0.05），见图4。

2.3利拉鲁肽处理后对NOS和COX2 mRNA表达变化利拉鲁肽处理6周后，各组大鼠肾脏内髓NOS和COX2的mRNA水平差异均有统计学意义（F分别为128.659、255.644，P<0.05），其中DMT组高于DM组（P<0.05），其他3组间差异无统计学意义（P＞0.05），见图5。

Fig.3　Changes of the blood concentrations of ion after treating with liraglutide for 6 weeks图3　利拉鲁肽处理6周后对血液离子浓度的影响

a与DM组比较，P<0.05Fig.4　Changes of the urine concentrations of ion after treating with liraglutide for 6 weeks图4　利拉鲁肽处理6周后对尿液离子浓度的影响

a与DM组比较，P<0.05Fig.5　Changes of the mRNA expressions of NOS and COS2 after treating with liraglutide for 6 weeks图5 利拉鲁肽处理6周后NOS和COX2的mRNA表达情况

2.4利拉鲁肽处理后NOS和COX2的蛋白表达变化利拉鲁肽处理6周后，各组NOS和COX2蛋白表达水平差异有统计学意义（F分别为71.587、153.176，P<0.05），DM组NOS表达量明显低于其他3组（P<0.05），DM组COX2表达量明显低于DMT和WTT组（P<0.05），但与WT组差异无统计学意义（P>0.05），见图6。

3　讨论

GLP-1降血压和调节水盐代谢的机制目前仍不明确。有报道表明，GLP-1通过G蛋白偶联受体GLP-1受体（GLP-1R）发挥功效，如在2型糖尿病和冠状动脉疾病的患者中，激活GLP-1R会使冠状动脉舒张，同时GLP-1R拮抗剂能完全拮抗GLP-1的作用［4］。另有研究发现啮齿类动物中GLP-1呈时间依赖性和剂量依赖性扩张肺动脉，是因为内皮系统合成NO的缘故［5］，且GLP-1通过NO/cGMP通路发挥扩血管作用，并不依赖于相应的GLP-1R［6］。值得注意的是，盐负荷时肾脏内髓NOS的表达增高［8］，且诱导肾脏内髓COX2的表达，NOS阻滞剂则抑制COX2的表达［9］。给予高盐饮食后，其肾脏内髓COX2表达显著升高［10］，而在肾脏内髓注射COX2抑制剂后，接受高盐饮食的大鼠血压升高［11］。

本研究发现GLP-1可能通过调节NOS，诱导COX2表达来发挥调节水盐和降血压的作用。本研究使用利拉鲁肽对2型糖尿病大鼠进行干预，结果显示利拉鲁肽具有明显的降血糖和降血压作用，尤其是尿液中的K、Na、Cl离子浓度均显著高于DM组，而血液中的K、Na、Cl离子浓度并无明显差异，提示利拉鲁肽可能促进了2型糖尿病大鼠肾脏的水盐代谢，调节了由于高血糖导致的渗透压升高，起到对肾脏的保护作用。笔者先前的研究还发现GLP-1可降低糖尿病伴高血压患者的血压和血压变异性，尤其是白昼收缩压、24 h收缩压变异性、白昼收缩压变异性等指标［3］。GLP-1通过增加大鼠尿钠等离子排泄，减轻体内钠潴留以降低血压，这一机制或许也是GLP-1降低血压变异性的生理基础。

正常肾脏中COX2主要表达在肾脏髓质间质细胞（renal medullary interstitial cells，RMICs）中，少部分表达于皮质致密斑［12］。RMICs沿着髓质血管和肾小管构成特殊的梯度结构，并与直小血管和肾小管的基底膜相毗邻，通过旁分泌作用产生某些介质直接影响髓质血流量和肾小管转运功能，进而调节肾小管水、钠重吸收［7］。因此，位于RMICs中的COX2极有可能催化产生某些前列腺素，通过旁分泌作用影响髓质血流量和肾小管转运，进而参与水盐代谢和血压的调节。如前所述，COX2在肾脏内髓的表达与NOS诱导调控有关。NO是一种重要的血管扩张因子，由3种类型的NO合成酶合成：内皮型NOS （eNOS），神经型NOS（nNOS）和诱导NOS（iNOS）。有研究报道，GLP-1通过NO发挥血管扩张功能［5］。因此，笔者推测NOS通过诱导髓内COX2表达，促进水钠排泄而降低肾脏内髓渗透压，以发挥保护肾脏的作用。本实验中利DMT组中NOS和COX2的表达均明显高于DM组，提示糖尿病患者长期血糖浓度升高，肾脏内髓渗透压随之升高，肾脏NOS和COX2表达降低，使用GLP-1类似物利拉鲁肽可有效提高内髓NOS和COX2的表达，加强肾脏利水钠作用。

综上所述，GLP-1类似物利拉鲁肽可能通过促进2型糖尿病大鼠肾脏内髓NOS和COX2的表达来调节渗透压，进而产生降压和利水盐作用，今后的研究有必要对其进一步的分子机制深入探讨，为GLP-1类似物的临床应用提供理论依据。

A：Western blot结果；B：蛋白相对定量；a与DM组比较，P<0.05Fig.6　Changes of the protein expressions of NOS and COS2 after treating with liraglutide for 6 weeks图6　利拉鲁肽处理6周后NOS和COX2的蛋白表达情况

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（2015-10-22收稿2016-02-05修回）

（本文编辑闫娟）

中图分类号：R587.1

文献标志码：A

DOI：10.11958/20150245

Liraglutide promotes the reduction of blood pressure and drives the water and salt through in renal medulla of type 2 diabetes rats

WANG Shaoqing1,MAO Nan1,ZHOU Ping1,WANG Li1△,GAO Fang1,WEI Yixun1,FAN Junming2,FU Ping3
1 Department of Nephrology,the First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College,Chengdu,Sichuan 610500,China；
2 Department of Nephrology,the Affiliated Traditional Medicine Hospital of Southwest Medical University；
3 Department of Nephrology,West China Hospital,Sichuan University
△Corresponding AuthorE-mail:93331524@qq.com

Abstract:ObjectiveTo observe the effects of glucagon like peptide-1(GLP-1)analogues liraglutide on expressions of nitric oxide synthase(NOS)and cyclo-oxygen-ase(COX)2 in renal medulla of type 2 diabetes rats,and the mechanism of its lowering blood pressure and promoting excretion of water and salt in kidney.MethodsType 2 diabetes model rats were generated by high-fat and high-sugar feeding for 8 weeks followed by intraperitoneal injection of streptozotocin(STZ).Subse⁃quently,eighteen type 2 diabetes rats were divided into two groups:liraglutide treatment group(DMT)and diabetes group (DM).Twelve normal rats were divided into two groups:liraglutide treatment wild type group(WTT)and wild type group (WT).DMT and WTT groups were given liraglutide(200 μg/kg)by subcutaneous injection,DM and WT groups were given equivalent normal saline by the same way.The levels of blood glucose and blood pressure were detected at 0,2,4 and 6 weeks after treatment in groups of rats.Samples of urine were collected for detecting ion concentrations(K+,Na+and Cl-)af⁃ter treatment for six weeks.Rats were sacrificed and blood samples were collected for detecting ion concentrations(K+,Na+and Cl-).The expression levels of NOS and COX2 mRNA and protein in renal medulla were detected by real-time PCR and Western blot assay.ResultsAfter treating with liraglutide,the values of blood glucose(F=5.933,P<0.05)and blood pres⁃sure(F=22.070,P<0.05)were gradually decreased in DMT group.After treatment with liraglutide for 6 weeks,the values of blood glucose(mmol/L:12.78±3.82 vs.18.75±1.68)and blood pressure(mmHg:119.98±4.43 vs.136.42±4.48)were signifi⁃cantly decreased(P<0.05)in DMT group than those of DM group(P<0.05).There were no significant differences in the concentrations of K+,Na+and Cl-between the two groups.There were higher levels of K+(mmol/L:46.55±6.43 vs.33.13± 9.71),Na+(mmol/L:56.33±8.83 vs.41.20±7.25)and Cl-(mmol/L:159.81±25.06 vs.71.44±12.99)in urine in DMT group than those of DM group(P<0.05).The mRNA levels and protein expressions of NOS and COX2 in renal medulla were significant⁃ly increased in DMT group than those of DM group(P<0.05).ConclusionGLP-1 analogues liraglutide may enhance the expression of COX2 by increasing the expression of NOS to excrete water and salt,and decrease blood pressure.

Key words：glucagon-like peptide-1;liraglutide;renal medulla;diabetes mellitus，type 2;nitric oxide synthase;cyclo⁃oxygenase 2