胞外pH值通过BMP-2信号通路影响高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化

张慧然，徐金升，郭利萍，白亚玲，张胜雷，张俊霞，崔立文

胞外pH值通过BMP-2信号通路影响高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化

张慧然，徐金升△，郭利萍，白亚玲，张胜雷，张俊霞，崔立文

摘要：目的探讨不同pH值环境下骨形态发生蛋白2（BMP-2）信号通路对高磷诱导大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）钙化的影响。方法选取5～8周龄健康雄性SD大鼠，体外分离培养大鼠胸主动脉VSMCs，取第4代VSMCs进行实验，设正常对照组、pH7.4+高磷组、pH7.1+高磷组和pH7.7+高磷组。采用茜素红染色及邻甲酚酞络合酮比色法检测细胞钙化情况，酶联免疫吸附法检测细胞碱性磷酸酶（AKP）活性，用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测BMP-2、Smad1及Runt相关转录因子2（Runx2）mRNA的表达。结果与正常对照组相比，pH7.4+高磷组大鼠VSMCs的钙含量增加、茜素红染色钙化结节增多，BMP-2、Smad1、Runx2 mRNA表达及AKP活性均增高（均P< 0.05）；与pH7.4+高磷组相比，pH7.1+高磷组大鼠VSMCs的钙含量减低、茜素红染色钙化结节减少，BMP-2、Smad1、Runx2 mRNA表达及AKP活性均降低（均P<0.05），pH7.7+高磷组大鼠VSMCs的钙含量增加、茜素红染色钙化结节增多，BMP-2、Smad1、Runx2 mRNA表达及AKP活性均增高（均P<0.05）。结论胞外酸性环境（pH7.1）抑制高磷诱导的大鼠VSMCs钙化，胞外碱性环境（pH7.7）促进高磷诱导的大鼠VSMCs钙化，其机制可能是通过BMP-2信号通路介导VSMCs表型转化。

关键词：肌细胞,平滑肌；氢离子浓度；骨形态发生蛋白质类；血管钙化；pH；骨形态发生蛋白2信号通路

基金项目：河北省自然科学基金资助项目（H2012206157）

作者单位：河北医科大学第四医院肾内科（邮编050011）

作者简介：张慧然（1978），女，硕士，主治医师，主要从事慢性肾脏病血管钙化方面研究

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通讯作者E-mail:xjs5766@126.com

终末期肾脏病（end-stage renal disease，ESRD）患者死亡的首要病因是心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）［1］。血管钙化的存在及其严重程度是ESRD患者CVD死亡率及全因死亡率的独立预测因子［2］。ESRD患者血管钙化主要发生在中膜，血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）表型转化是血管中膜钙化的主要机制之一。有研究表明，胞外酸碱环境（pH值）对VSMCs钙化有一定影响，即酸性环境抑制VSMCs钙化，碱性环境促进VSMCs钙化［3-4］，但是胞外不同pH值对VSMCs钙化的具体作用机制尚不明确。为此，本研究以高磷诱导大鼠VSMCs钙化模型，观察胞外不同pH值环境对VSMCs钙化的影响。

1　材料与方法

1.1材料 （1）动物与试剂。选取5～8周龄清洁级健康雄性SD大鼠6只，体质量80～100 g，购自河北医科大学实验动物中心，动物合格证标号：1305090。胎牛血清、DMEM培养基（美国GIBCO公司）；β-甘油磷酸（美国Sigma公司）；SP免疫组化试剂盒（上海博海生物工程开发有限公司）；钙测定试剂盒（邻甲酚酞络合酮比色法，中生北控生物科技股份有限公司）；二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒（上海博海生物工程）；RNA反转录试剂盒（美国Therom公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；碱性磷酸酶（AKP）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；PCR引物（上海英潍捷基公司）。（2）仪器与设备。倒置相差显微镜（LH50A型，日本OLYMPUS公司）；酶标仪（美国Biotek公司）；PCR仪（美国ABI公司）；酸度计（北京赛多利斯科学仪器有限公司）。

1.2方法

1.2.1大鼠VSMCs原代培养及实验分组随机抽取2只大鼠，采用2%戊巴比妥钠麻醉后用75%乙醇浸泡，在无菌条件下分离出胸主动脉，剥去外膜，纵向剪开管壁，然后用纱布轻轻擦除内膜，将中膜剪成1 mm×1 mm×1 mm左右的小块，加入含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 mg/L链霉素的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养，48 h后更换新鲜培养基。此后每隔2～3 d换液1次，倒置相差显微镜下观察细胞生长状况，直至细胞接近80%～90%融合时进行传代。此后每隔3～4 d传代1次，取第4代VSMCs进行实验。实验设正常对照组、pH7.4+高磷组、pH7.1+高磷组和pH7.7+高磷组。正常对照组采用含10%胎牛血清培养基培养，调整pH值为7.4；pH7.4+高磷组、pH7.1+高磷组和pH7.7+高磷组采用高磷培养基（10 mmol/L β-甘油磷酸+10%胎牛血清）培养，分别将培养基pH值调整为7.4、7.1和7.7，使用1 mol/L HCl和7.4%NaHCO3调整培养基pH值，每天换液1次。将剩余4只大鼠按照上述方法培养，实验重复2次。

1.2.2细胞鉴定VSMCs的鉴别方法同本课题组前期实验［5］。

1.2.3细胞钙化检测 （1）茜素红染色。取3代细胞以5× 104/孔密度接种于12孔板内，实验每组设3个复孔，各实验组给予不同处理因素14 d后，用细胞茜素红钙染色试剂对样本进行固定、染色及澄清处理，倒置显微镜下观察钙结节染色情况，每样本随机读取1个视野（×100）。结果判断标准：钙盐沉积为橘红色。（2）测定细胞内钙含量取3代细胞以5× 104/孔密度接种于12孔板内，实验每组设3个复孔，各实验组给予不同处理因素14 d后，细胞用盐酸脱钙取上清，钙测定试剂盒测定钙含量，脱钙后的细胞用0.1 mol/L NaOH和0.1%十二烷基硫酸钠（SDS）溶解30 min，BCA法测定细胞蛋白含量，结果用细胞钙含量比蛋白含量表示（mg/g蛋白）。

1.2.4酶联免疫吸附法测定细胞AKP活性取3代细胞以5×104/孔密度接种于12孔板内，实验每组设3个复孔，各实验组给予不同处理因素14 d后，每孔加入200 μL 0.1% Triton X-100置4℃环境中24 h，然后反复吹打裂解细胞后置于离心管中离心，以1 000 r/min离心5 min，取上清液按试剂盒说明书进行操作，于酶标仪520 nm波长处测定吸光度值，BCA法测定细胞蛋白含量，结果用蛋白校准（U/g蛋白）。

1.2.5反转录聚合酶链反应（RT-PCR）测定Runt相关转录因子2（Runx2）、骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP-2）、Smad1 mRNA的表达取4代细胞，各实验组给予不同处理因素4 d后，采用RNA分离试剂盒，Trizol提取并纯化总RNA。PCR反应在PCR仪上进行，反应程序为：95℃5 min；95℃30 s，55℃30 s，58℃45 s，35个循环；72℃10 min。取PCR产物，行琼脂糖凝胶电泳。实验重复3次，以GAPDH作为内对照，计算相对含量。各基因扩增引物序列见表1。 Tab.1A list of primers used in the reactions

表1　各目的基因引物序列

1.3统计学方法采用SPSS 17.0软件对数据进行统计学处理，符合正态分布的计量资料用均数±标准差（±s）表示，pH7.4+高磷组与正常对照组比较采用t检验，不同pH值+高磷组间均数比较采用单因素方差分析（ANOVA），组间多重比较行LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1不同pH值对高磷诱导大鼠VSMCs钙化的影响茜素红染色结果显示，与正常对照组相比，pH7.4+高磷组的橘红色矿化结节明显增多；与pH7.4+高磷组相比，pH7.1+高磷组的橘红色矿化结节明显减少，pH7.7+高磷组的橘红色矿化结节明显增多，见图1。钙含量测定结果与茜素红染色结果基本一致，且差异均有统计学意义（P<0.05），见表2。

1：正常对照组；2：pH7.4+高磷组；3：pH7.1+高磷组；4：pH7.7+高磷组；橘红色结节为钙化结节Fig.1　Alizarin red staining of VSMCs in different goups（×100）图1　各组大鼠VSMCs茜素红染色（×100）

Tab.2　Calcium content and activity of AKP in different goups表2各组大鼠VSMCs钙含量及AKP活性的比较（n=9，±s）

Tab.2　Calcium content and activity of AKP in different goups表2各组大鼠VSMCs钙含量及AKP活性的比较（n=9，±s）

P＜0.05；t为pH7.4+高磷组与正常对照组比较，F为不同pH值高磷组间比较，其中b与pH 7.4+高磷组比较，c与pH 7.1+高磷组比较，P<0.05

组别正常对照组pH7.4+高磷组pH7.1+高磷组pH7.7+高磷组钙含量（mg/g蛋白）21.24±3.70 88.69±8.15 68.15±7.27b106.77±7.69bc7.045＊64.527＊AKP活性（U/g蛋白）22.84±3.98 98.50±7.25 56.72±3.98b150.72±7.15bc5.019＊94.385＊t F

2.2不同pH值对高磷诱导的大鼠VSMCs AKP活性的影响与正常对照组相比，pH7.4+高磷组AKP活性明显增强（P<0.05）；与pH7.4+高磷组相比，pH7.1+高磷组AKP活性明显减弱，pH7.7+高磷组AKP活性明显增强（P<0.05），见表2。

2.3不同pH值对高磷诱导大鼠VSMCs中BMP-2、Smad1和Runx2 mRNA表达的影响与正常对照组相比，pH7.4+高磷组BMP-2、Smad1和Runx2 mRNA表达水平明显增强（P<0.05）；与pH 7.4+高磷组相比，pH7.1+高磷组BMP-2、Smad1和Runx2 mRNA表达水平明显减弱，pH7.7+高磷组BMP-2、Smad1和Runx2 mRNA表达水平明显增强（P< 0.05），见图2。

3　讨论

血管钙化在ESRD患者中普遍存在，主要表现为血管中膜钙化，而VSMCs是组成血管中膜的主要成分，是血管中膜发生钙化的结构基础［6-8］。高磷血症在ESRD患者中很常见，是血管钙化，特别是中膜钙化的关键诱导因子［9］。ESRD患者通常合并不同程度的代谢性酸中毒，而随着透析的干预，酸中毒被纠正，pH值逐渐升高，但不同pH值环境对血管钙化的影响尚未明确。据报道，当pH值从7.4降至6.9时，羟磷灰石中钙和磷酸盐的溶解度分别增加2和4倍［10］。酸性环境抑制了羟磷灰石的产生及其在软组织的沉积。本实验依据人体内环境pH值，以pH<7.4为酸性环境，pH>7.4为碱性环境，以高磷诱导大鼠VSMCs钙化模型，经茜素红染色和钙含量测定结果显示，pH7.4+高磷可以诱导VSMCs发生钙化，而当pH值降至7.1时钙化减弱，pH值升至7.7时钙化加重，提示胞外酸性环境（pH7.1）可抑制VSMCs发生钙化，胞外碱性环境（pH7.7）可促进VSMCs发生钙化。

Fig.2　Target gene expressions of VSMCs in different groups detected by RT-PCR图2RT-PCR检测各组大鼠VSMCs目的基因表达情况

近年对血管钙化的细胞分子机制研究表明，血管钙化是主动的、可预防、可逆转和高度可调控的类成骨过程，其中VSMCs的成骨/成软骨样表型转化起着关键作用。Runx2是VSMCs成骨/成软骨样表型转化的核心转录因子［11］。AKP是VSMCs发生表型转化的早期标志物，其在正常的VSMCs中活性水平较低，但在钙化的VSMCs中活性水平明显增高［12］。为了证实不同pH值是否与VSMCs表型转化直接相关，本实验检测了大鼠VSMCs中Runx2 mRNA表达及AKP活性，结果显示，pH7.4+高磷上调了Runx2 mRNA表达及AKP活性，而当pH值降至7.1时这一过程被减弱，pH值升至7.7时这一过程被增强，提示胞外酸性环境（pH7.1）抑制了VSMCs表型转化，胞外碱性环境（pH7.7）促进了VSMCs表型转化。

BMP-2信号通路在VSMCs表型转化中起着关键性的作用［13］。BMP-2与细胞膜表面受体结合从而磷酸化下游的Smad1/5/8，活化的Smad1/5/8与Smad4形成复合物转入胞核内，与不同的DNA结合蛋白结合，引起下游靶基因的转录［14］。复合物转入胞核内可上调Runx2、Osterix（OSX）和同源盒基因（Msx）等基因，促进成骨分化。BMP-2信号通路还可以上调AKP、Ⅰ型胶原（collagen type I，Col I）、骨钙素（osteocalcin，OCN）、骨桥蛋白（osteoprontin，OPN）和骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）等成骨特异性标志物的表达［15］。为进一步研究BMP-2信号通路在不同pH值影响VSMCs成骨/成软骨样表型转化中的作用，本实验检测了BMP-2 mRNA和BMP-2信号通路效应基因Smad1 mRNA表达：与正常对照组相比，pH7.4+高磷组VSMCs BMP-2 mRNA及其下游的Smad1 mRNA的表达均升高；与pH7.4+高磷组相比，pH7.1+高磷组BMP-2、Smad1 mRNA的表达均降低，pH7.7+高磷组BMP-2、Smad1 mRNA的表达均升高，提示BMP-2信号通路参与了不同pH值影响VSMCs成骨/成软骨样表型转化的过程。

综上所述，BMP-2信号通路参与了不同pH值影响的高磷诱导的VSMCs表型转化及钙化过程。胞外酸性环境（pH7.1）可下调BMP-2信号通路相关基因的表达，抑制VSMCs成骨/成软骨样表型转化，表现为Runx2表达减少、AKP活性降低，进而抑制VSMCs钙化；而胞外碱性环境（pH7.7）对VSMCs钙化的作用与上述过程相反。上述结果为进一步研究体内酸性及碱性环境对VSMCs钙化的影响提供了实验依据。

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（2015-08-18收稿2016-03-18修回）

（本文编辑陈丽洁）

中图分类号：R692.5

文献标志码：A

DOI：10.11958/20150117

Extracelluar pH values influence high-phosphorus-induced VSMCs calcification mediated by BMP-2 signaling pathway

ZHANG Huiran,XU Jinsheng△,GUO Liping,BAI Yaling,ZHANG Shenglei,ZHANG Junxia,CUI Liwen Department of Nephrology,the Forth Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050011,China
△Corresponding AuthorE-mail：xjs5766@126.com

Abstract：ObjectiveTo explore the effect of different pH values on calcification of rat vascular smooth muscle cells (VSMCs)through bone morphogenetic protein(BMP)-2 signaling pathway.MethodsHealthy male SD rats aged 5-8 weeks were selected in the study.VSMCs from rat thoracic aorta were cultured in vitro,and then identified by immunocytochemistry. The VSMCs were randomly divided into 4 groups by random sampling method:normal group(pH 7.4),pH7.4+high phosphorus group,pH 7.1+high phosphorus group,and pH 7.7+high phosphorus group.Calcium deposition and alkaline phosphatase(AKP) activity were measured by alizarin red staining and enzyme linked immunosorbent assay.The expressions of BMP-2,Smad1 and Runx2 mRNA were detected by RT-PCR.ResultsCompared with the control group,the calcification staining was increased in pH 7.4+high phosphorus group,calcium content was increased and expressions of BMP-2,Smad1,Runx2 mRNA and AKP activity were also increased(P<0.05).While compared with the pH 7.4+high phosphorus group,calcification staining,calcium content,expressions of BMP-2,Smad1,Runx2 mRNA and AKP activity were decreased in pH 7.1+high phosphorus group(P< 0.05).The calcification staining,calcium content,expressions of BMP-2,Smad1,Runx2 mRNA and AKP activity were increased in pH 7.7+high phosphorus group(P<0.05).ConclusionThe extracellular acidic environment(pH 7.1)can inhibit highphosphotus-induced VSMCs calcification,whereas extracellular alkaline environment(pH 7.7)induce high-phosphotus-induced VSMCs calcification.The mechanism is presumably that VSMCs calcification is induced by influencing BMP-2 pathway,which may be mediated by VSMCs phenotype transdifferentiation of BMP-2 signaling pathway.

Key words:myocytes,smooth muscle;hydrogen-ion concentration;bone morphogenetic proteins;vascular calcification; pH;BMP-2 signaling pathway