虾青素对人肺癌A549细胞裸鼠移植瘤放疗敏感性的影响

吴春涛，苑威，刘铁楠，张晋冀，李长仔，胡宝山

虾青素对人肺癌A549细胞裸鼠移植瘤放疗敏感性的影响

吴春涛1，苑威2，刘铁楠3，张晋冀1，李长仔1，胡宝山1

摘要：目的探讨虾青素对人肺癌A549细胞裸鼠移植瘤放射治疗敏感性的影响。方法20只BALB/c Nude裸鼠随机均分为4组：对照组（小鼠灌胃10%DMSO的超纯水），虾青素组（小鼠灌胃10%DMSO的虾青素悬液，剂量为50 mg/kg，每隔1 d给药1次，共给药7次），照射组（小鼠灌胃10%DMSO的超纯水，肿瘤生长部位使用加速器局部照射，5 Gy/次，总剂量15 Gy）及联合组（同时进行虾青素灌胃和局部照射处理）。肿瘤最短直径达到5 mm以上开始实验，每隔1 d测量移植瘤长短直径计算肿瘤体积并绘制移植瘤生长曲线，末次给药后第2天处死小鼠，取肿瘤块称质量并将其制成石蜡切片。免疫组化方法检测石蜡切片内肿瘤细胞增殖抗原Ki-67、磷酸化STAT3（p-STAT3）表达及细胞凋亡（Tunnel染色）情况。结果与对照组比较，虾青素组、照射组及联合组瘤体生长速度减慢（P<0.05），以联合组瘤体生长速度最慢。对照组、虾青素组、照射组和联合组瘤体质量、Ki-67、p-STAT3表达水平均依次降低，抑瘤率、细胞凋亡率均依次升高，组间多重比较差异均有统计学意义（P<0.05）。结论虾青素能够通过抑制p-STAT3表达增加肺癌A549细胞裸鼠移植瘤的放疗敏感性。

关键词：肺肿瘤；癌；辐射耐受性；放射疗法；小鼠,裸；虾青素；肺癌A549细胞

基金项目：中国煤炭工业协会指导性课题（MTKJ2014-286）

作者单位：1华北理工大学附属医院肿瘤外科（邮编063000），2药学部，3心内科

作者简介：吴春涛（1976），男，副主任医师，医学学士，主要从事肿瘤治疗学方面的研究

肺癌是一类高发病率肿瘤，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第1位［1］。在肺癌的治疗过程中，放射治疗是一种重要的治疗方法，不同分型的肺癌对放射治疗的敏感性存在差异。虾青素是一种天然的类胡萝卜素，广泛的存在于自然界中，有研究显示其具有抗氧化、抗肿瘤、预防癌症、增强免疫力、改善视力等作用［2-3］。研究表明，虾青素能够通过阻断酪氨酸激酶1（Janus activedkinase，JAK1）/信号转导和转录活化因子3（Signal transducers and activators of transcription，STAT3）通路来抑制非小细胞肺癌A549细胞增殖并促进其凋亡。此外，虾青素能够通过作用于JAK/STAT3信号通路来抑制口腔癌及克隆性结肠癌细胞增殖并促进其凋亡［4-5］，提示虾青素能够通过影响STAT3表达发挥体外抗肿瘤作用。STAT3是一种转录活化因子，通过与细胞中多种功能调节蛋白相互结合在癌症的发生发展中发挥重要的调控作用。研究显示应用STAT3抑制剂能够增加包括非小细胞肺癌A549细胞在内的多种肺癌细胞的放疗敏感性［6-7］，而具有抑制STAT3表达且不良反应低的虾青素是否能够增加A549细胞放疗敏感性尚少见报道。本研究通过建立裸鼠移植瘤模型，从动物水平观察虾青素对裸鼠肺癌A549细胞移植瘤放射治疗的协同作用，为肺癌的临床治疗提供理论支持及实验指导。

1　材料与方法

1.1材料与仪器肺癌A549细胞系购自中科院上海生命科学研究所；虾青素购自日本Santa Cruz公司，每10 mg粉末溶解于100 μL DMSO后加入超纯水配置浓度为10 g/L的虾青素悬液备用；RPMI 1640培养基购自赛默飞世尔生物化学制品有限公司；胎牛血清购自美国GIBCO公司；Ki-67抗体购自美国Abcam公司，Tunnel检测试剂盒购自瑞士罗氏公司；磷酸化STAT3（p-STAT3）抗体购自美国CST公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；细胞培养箱购自美国Thermo公司。

1.2实验动物SPF级BALB/c Nude裸鼠30只，6～8周龄，体质量18～20 g，购自北京维通利华实验动物有限公司，饲养于华北理工大学实验动物中心。

1.3细胞培养肺癌A549细胞培养条件为RPMI 1640培养基内加入10%胎牛血清和青霉素100 U/mL、链霉素100 mg/L，细胞培养于37℃含5%CO2的培养箱内，选取对数生长期的细胞进行裸鼠接种实验。

1.4裸鼠移植瘤模型建立选取对数生长期的肺癌A549细胞，用0.25%胰酶消化后，使用含10%胎牛血清的培养基终止消化，收集细胞悬液到15 mL离心管内，以离心半径25 cm，1 500 r/min，离心5 min。弃上清后加入200 μL磷酸盐缓冲液（PBS）制成单细胞悬液，台盼蓝计数活细胞数占95%以上。调整细胞悬液浓度为5×107/mL，于裸鼠左前腋下及右前腋下接种，每只小鼠接种100 μL细胞悬液，共接种5只小鼠，接种1周左右开始形成肿瘤，3只小鼠肿瘤接种成功。接种后1个月将形成肿瘤的小鼠处死，取出肿瘤组织，去除包膜用剪刀剪成约100 mm3大小的瘤块，用穿刺针将瘤块接种至新的25只裸鼠左前腋下，待肿瘤最短直径＞5 mm后开始进行实验，本次造模22只裸鼠肿瘤接种成功，取20只肿瘤组织大小均匀的小鼠进行实验。

1.5实验分组20只BALB/c裸鼠采用随机数字表法均分为4组（n=5）。对照组，灌胃10%DMSO的超纯水；虾青素组，灌胃虾青素悬液，给药剂量为50 mg/kg，每隔1 d给药1次，共7次；照射组，每只小鼠灌胃含10%DMSO的超纯水，同时用直线加速器进行局部照射肿瘤，每次照射剂量为5 Gy，每隔3 d照射1次，照射总剂量为15 Gy；联合组，同时给予虾青素组和照射组的处理方法。

1.6移植瘤生长情况每隔1天测量移植瘤裸鼠体质量，游标卡尺测量肿瘤最长直径（a）及最短直径（b），按照公式V= a×b2/2计算移植瘤体积并绘制生长曲线。给药结束后第2天脱臼处死小鼠，分离瘤块，称质量后计算抑瘤率=（对照组瘤质量-处理组瘤质量）/对照组瘤质量。

1.7免疫组化实验检测Ki-67、p-STAT3表达水平及肺癌细胞凋亡率将获取的肿瘤组织迅速放入4%中性甲醛内，固定24 h以上做脱水、浸蜡处理后进行瘤块石蜡包埋，5 μm厚连续切片。增殖细胞表面抗原Ki-67及p-STAT3抗体染色步骤如下：常规脱蜡水化处理后进行抗原修复、内源性辣根过氧化物酶灭活，抗原封闭后，分别加入Ki-67抗体（1∶800）和p-STAT3抗体（1∶500），4℃隔夜孵育，洗去多余未结合的抗体，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗，室温孵育30 min，DAB显色后进行常规水化透明步骤，加入封片剂封片后显微镜下观察结果。细胞凋亡采用Tunnel染色参照试剂盒标准步骤进行，染色结束后进行水化透明封片处理后观察结果。任意读取5个视野，计数镜下100个细胞内阳性细胞数目，计算阳性细胞百分率即细胞凋亡率。

1.8统计学方法采用SPSS 19.0对数据进行处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间均数比较采用方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1虾青素对裸鼠移植瘤放疗后瘤体生长速度的影响未做任何处理的对照组瘤体生长速度很快，与对照组比较，虾青素组、照射组及联合组瘤体生长速度减慢，以联合组瘤体生长速度最慢，经放疗和虾青素同时处理后的联合组瘤体几乎未增长，见图1。

2.2虾青素对裸鼠移植瘤放疗后瘤体质量的影响对照组、虾青素组、照射组和联合组瘤体质量依次降低，抑瘤率依次升高，组间多重比较差异均有统计学意义，见表1。

Fig.1　Astaxanthin slowed down the growth rates of transplanted tumor in nude mice after radiotherapy图1　虾青素降低裸鼠移植瘤的放疗后瘤体生长速度

Tab.1　Astaxanthin decreased weight of transplanted tumor in nude mice after radiotherapy表1　虾青素降低裸鼠移植瘤的放疗后瘤体质量（n=5，±s）

Tab.1　Astaxanthin decreased weight of transplanted tumor in nude mice after radiotherapy表1　虾青素降低裸鼠移植瘤的放疗后瘤体质量（n=5，±s）

＊P＜0.05；a与对照组比较，b与虾青素组比较，c与照射组比较，P＜0.05

组别对照组虾青素组照射组联合组F瘤体质量（g）1.53±0.07 1.29±0.10a0.82±0.09ab0.29±0.03abc48.435＊抑瘤率（%）-15.7±7.0 46.1±6.6b81.0±1.9bc126.400＊

2.3虾青素对裸鼠移植瘤放疗后癌细胞凋亡及p-STAT3表达的影响对照组、虾青素组、照射组和联合组Ki-67、p-STAT3表达水平均依次降低，细胞凋亡率依次升高，组间多重比较差异均有统计学意义（P<0.05），见表2、图2。

Tab.2　Effects of astaxanthin on expressions of Ki-67 and p-STAT3，and apoptotic rates of transplanted tumor in nude mice after radiotherapy表2　虾青素对裸鼠移植瘤放疗后Ki-67、p-STAT3表达及细胞凋亡率的影响　　（n=5，%±s）

Tab.2　Effects of astaxanthin on expressions of Ki-67 and p-STAT3，and apoptotic rates of transplanted tumor in nude mice after radiotherapy表2　虾青素对裸鼠移植瘤放疗后Ki-67、p-STAT3表达及细胞凋亡率的影响　　（n=5，%±s）

＊P＜0.05；a与对照组比较，b与虾青素组比较，c与照射组比较，P＜0.05

组别对照组虾青素组照射组联合组F Ki-67 74.2±5.2 65.0±3.8a49.0±5.0ab35.2±4.1abc70.600＊p-STAT3 40.4±7.2 33.0±3.8a25.4±5.4ab5.0±2.2abc46.008＊细胞凋亡率0 13.2±4.4a51.4±7.9ab80.4±6.2abc221.166＊

Fig.2　Staining image of Ki-67，p-STAT3 in transplanted tumor after radiotherapy图2　各组Ki-67、p-STAT3表达及Tunnel染色结果（Ki-67，×100；Tunnel，×400；p-STAT3，×100）

3　讨论

放射治疗是利用放射线包括X射线、电子线、中子束、质子束及其他粒子束等治疗恶性肿瘤的一种重要方法，但是许多恶性肿瘤在放疗后出现了不同程度的辐射耐受。非小细胞肺癌和小细胞肺癌的5年生存率分别为16%和6%，临床治疗肺癌预后差的主要原因是肺癌容易出现放疗和化疗的耐受性［7］，因此，如何提高肺癌的放疗敏感性至关重要。有研究报道，肿瘤细胞对辐射的耐受性及敏感性与STAT3的激活有关，抑制STAT3信号通路能够降低胰腺癌［8］、乳腺癌［9］、肺癌［6-7］、神经胶质瘤［10］等多种肿瘤细胞的辐射耐受性，STAT3在介导肿瘤细胞辐射耐受过程中发挥重要作用。研究显示氯硝柳胺和CK2抑制剂能够通过抑制STAT3增加肺癌细胞的放疗及化疗敏感性，但是以上研究只限于体外肺癌细胞的研究，而无裸鼠移植瘤模型的体内实验［6-7］。虾青素能够通过抑制STAT3信号通路发挥体外抗肿瘤作用，而其是否具有增加肺癌放疗敏感性的作用尚不清楚。

本研究结果显示，对照组裸鼠移植瘤生长迅速，虾青素组移植瘤体积及质量均低于对照组，但是抑瘤率低于30%，未达到《现代肿瘤治疗药物学》中抗肿瘤药物有效标准［11］，提示单纯应用虾青素进行体内抗肿瘤作用并不理想，这与既往报道的虾青素能够体内抑制肝癌细胞生长的结果并不一致［5］，提示虾青素的抗肿瘤作用可能存在组织器官的差异性。本研究中联合组瘤体几乎未增长，在实验结束之时无论是肿瘤体积还是肿瘤质量都远低于其他3组，说明在放疗同时给予裸鼠虾青素干预能够有效抑制肺癌生长。

Ki-67是一种增殖细胞相关的核抗原，可以通过对Ki-67检测判断肿瘤细胞的增殖活性，肿瘤细胞增殖旺盛则Ki-67表达水平高。本研究结果显示，与对照组比较，虾青素组、照射组及联合组Ki-67表达水平不同程度下调，以联合组Ki-67表达水平最低，提示放疗同时给予虾青素干预能够有效降低肿瘤细胞增殖。脱氧核苷酸末端转移酶（Terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT）介导的dUTP缺口末端标记（TdT-mediated dUTP nick-end labeling，Tunnel）技术是目前原位检测细胞凋亡最敏感、快速、特异的方法。本研究采用Tunnel技术检测细胞凋亡率，结果显示，对照组肿瘤细胞几乎没有凋亡发生，虾青素组、照射组及联合组细胞凋亡率均高于对照组，以联合组细胞凋亡率最高，说明放疗同时给予虾青素能够增加肿瘤细胞凋亡。

为验证虾青素是否通过抑制STAT3信号通路来增加肺癌放疗敏感性，本研究对肿瘤组织活化状态的STAT3——p-STAT3的表达进行检测，结果显示，p-STAT3在对照组中表达水平较高，虾青素组、照射组及联合组p-STAT3表达均较对照组降低，以联合组p-STAT3表达水平最低，提示虾青素可能通过下调p-STAT3表达起到增加放疗敏感性的作用，与之前多项研究结果一致［6-7］。

综上所述，虾青素能够通过调控p-STAT3表达水平来增加肺癌A549细胞裸鼠移植瘤放疗敏感性，下一步需要深入研究虾青素对p-STAT3上游及下游信号分子的调控作用。

参考文献

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（2015-11-25收稿2016-03-22修回）

（本文编辑陈丽洁）

中图分类号：R730.52，R730.55

文献标志码：A

DOI：10.11958/20150340

Astaxanthin enhanced radiotherapy sensitivity of human lung cancer A549 cells transplanted in nude mice

WU Chuntao1,YUAN Wei2,LIU Tienan3,ZHANG Jinji1,LI Changzai1,HU Baoshan1
1 Department of Oncological Surgery,2 Department of Pharmaceutical,3 Department of Cardiology,North China University of Science and Technology Affiliated Hospital,Tangshan 063000,China

Abstract:ObjectiveTo observe the effect of astaxanthin on radiotherapy sensitivity of lung cancer A549 cells transplanted in nude mice.MethodsTwenty BALB/c nude mice were divided into four groups:control group(mice were gavaged with pure water containing with 10%DMSO),astaxanthin group(mice were gavaged with astaxanthin suspension containing with 10%DMSO,astaxanthin was given to mice with the dose of 50 mg/kg on the first day,and every other day in the following days with a total of 7 times),radiotherapy group(mice were gavaged with pure water containing with 10% DMSO,the tumor site was given local radiotherapy with a dose of 5 Gy per time and the total dose was 15 Gy)and combination group(mice were given 50 mg/kg astaxanthin and radiotherapy with 15 Gy total irradiated dose).When the minor axis of the tumor reached 5 mm we began experiment.Tumor growth curve was measured by detecting the line of apsides every other day.Mice were killed on the second day after the last time of astaxanthin administration.Weights of tumor were measured by a balance and then tumor mass was processed into paraffin sections.Expressions of proliferating tumor cell antigen Ki-67,phosphorylated-signal transducers and activators of transcription(p-STAT3),and cell apoptosis (measured by terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick-end labeling,Tunnel)were detected by immunohistochemistry.ResultsCompared with control group,the transplanted tumor growth rate slowed down in other three groups(P<0.05),and tumor growth was the most slowly in the combination group.Tumor weight,Ki-67 and p-STAT3 expressions were decreased gradually in turn in control group,astaxanthin group,radiotherapy group and combination group. The anti-tumor rate and percentage of cell apoptosis were increased gradually in turn.There was significant difference between groups by multiple comparison statistics(P<0.05).ConclusionAstaxanthin enhances radiotherapy sensitivity of human lung cancer A549 cells in nude mice by down-regulating the expression of p-STAT3.

Key words:lung neoplasms;carcinoma;radiation tolerance;radiotherapy;mice,nude;Astaxanthin;lung cancer A549 cell