雌激素受体基因多态性与黄褐斑发病的关系

白朝

雌激素受体基因多态性与黄褐斑发病的关系

白朝

摘要：目的探讨雌激素受体（ER）基因多态性与黄褐斑发病的关系。方法选取56例眼袋处黄褐斑眼袋整形术患者（病例组）以及39例自愿接受眼袋整形术的健康女性（对照组），采用免疫组化检测不同ER表达，聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术分析2组ERα基因PvuⅡ和XbaⅠ酶切位点基因多态性及ERβ基因RsaⅠ和AluⅠ酶切位点基因多态性，探讨ER与黄褐斑发病严重程度评分的关系。结果免疫组化结果显示，病例组部分真皮纤维细胞和血管内皮细胞ERα和ERβ呈阳性表达，而对照组则表达较弱。Spearman相关性分析显示，ERα和ERβ与黄褐斑评分均呈正相关（rs分别为0.462和0.512，P＜0.05）。ERα基因XbaⅠ基因型在2组中分布差异有统计学意义（P＜0.05），以xx基因型为参照，暴露于X等位基因（Xx+XX）的OR值为2.23（95%CI：1.41～3.89，P＜0.05），ERβ基因AluⅠ基因型在2组中分布差异有统计学意义（P＜0.05），以aa基因型为参照，暴露于A等位基因（AA+Aa）的OR值为1.58（95%CI：1.21～4.29，P＜0.05），RsaⅠ基因型在2组中分布差异有统计学意义（P＜0.05），以rr基因型为参照，暴露于R等位基因（RR+Rr）的OR值为2.37（95%CI：1.19～6.33，P＜0.05）。结论黄褐斑的发病与ERα基因XbaⅠ基因型、ERβ基因AluⅠ、RsaⅠ基因型多态性有关，突变基因增加了黄褐斑发病的风险，其中Xx、Aa和RR基因型易患病。

关键词：黑变病；雌激素受体α；雌激素受体β；多态现象，遗传；黄褐斑

黄褐斑是临床上较为常见的色素沉着性皮肤疾病，主要表现为面部、鼻根部色素沉着，且多发于女性。该病与内分泌紊乱、月经不调、睡眠不佳等因素有关［1］。临床和基础研究均证实，雌激素受体（ER）升高与黄褐斑的发病有一定相关性［2］，但也有研究认为两者没有明显相关性［3］。目前，黄褐斑尚无非常有效的治疗方法［4］。本研究旨在进一步探讨ER基因多态性与黄褐斑发病的关系，为临床提供理论依据。

1　资料与方法

1.1临床资料选取2013年3月—2015年6月在我院皮肤科门诊就诊的56例眼袋处黄褐斑眼袋整形术患者（病例组），均为女性，年龄19～47岁，平均（28.45±4.37）岁，所有患者均符合参考文献［5］诊断标准，患者在3个月内未服用任何激素类药物，且无系统性和免疫性皮肤疾病。另选取我院同期自愿接受眼袋整形术的39例健康女性作为对照组，年龄20～48岁，平均（29.13±4.52）岁。所有受试对象均签署知情同意书，并报医院伦理委员会批准执行。

1.2实验方法

1.2.1黄褐斑严重程度评分采用安琪儿色素分析软件（广州比特公司生产），其中皮损面积评分：0分为无皮损，1分为眼袋每侧皮损面积＜2 cm2，2分为皮损面积2～4 cm2，3分为皮损面积＞4 cm2。皮损颜色评分：0分为正常肤色，1分为淡褐色，2分为褐色或者褐棕色，3分为深褐色，总积分=皮损面积评分+皮损颜色评分。

1.2.2免疫组化取眼袋整形术后外眦处多余皮肤组织做免疫组化。采用SP法进行染色，组织经石蜡切片、3%H2O2甲醇水溶液室温孵育10 min，正常山羊血清封闭10 min，加入ERα、ERβ抗体在湿盒中，室温孵育1～2 h，滴加生物素二抗，DAB染色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯脱水，中性树脂封片。镜检。表皮层采用半定量进行判定：（1）ERβ染色强度，无染色记0分，染色浅淡记为1分，黄色记为2分，棕黄色记为3分；ERα染色强度，无染色记0分，染色浅黄记为1分，黄色或黄褐色记为2分，深褐色记为3分。（2）阳性细胞计数。在400倍镜下任意读取5个视野，其中阳性细胞比例在5%以下为阴性，记0分，5%～25%计为1分，26%～ 50%计为2分，50%以上计为3分。（1）项和（2）项合计，0分为（-），1～2分为（+），3～4分为（++），5～6分为（+++）。

1.2.3聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）分析技术 （1）标本采集。分别抽取2组空腹肘正中静脉血约6 mL，置于真空管中，标本放置于-80℃冰箱中保存备用。（2）引物合成。按照相关文献［6］设计引物，由上海生工生物工程有限公司合成。对于ERα基因特异性扩增PvuⅡ、XbaⅠ多态位DNA引物序列，即P1：5′-CGTAGCTTACGC⁃GCTGTACTACGCTACAGTCGCGGACTAGC-3′，P2：5′-TAGCGTCGTACGGCTTACGCGCCTACGCTCGCGA-3′，PCR产物片段的长度为1.4 kb；对于ERβ基因特异性扩增RsaⅠ、AluⅠ多态位DNA引物序列，即P3：5′-GCTCGACGGCTACG⁃TAAGCTACGACGTTAATTCGCGACGC-3′，PCR产物片段的长度为157 bp；P4：5′-CGTAGCTGTACTCGACGACAGCGCG⁃TATCGACGACAGGC-3′，PCR产物片段的长度为306 bp。（3）全血DNA提取。取含有EDTA抗凝血2 mL，用基因组DNA提取试剂盒（Promega公司，美国）提取DNA，保存于-40℃冰箱中备用。（4）PCR-RLFP检测。对于ERα基因片段选择的PCR扩增条件为反应总体系25 μL，其中含有血基因组DNA 0.1 μg，2×MasterMix 12.5 μL，引物各0.6 μmol/L，三蒸水9.5 μL，PCR扩增反应95℃预变性2.5 min，94℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸75 s，共计30个循环，最后采用72℃延伸4.5 min。对于ERβ基因RsaⅠ片段选择的PCR扩增条件为反应总体系30 μL，其中含有血基因组DNA 0.15 μg，2×MasterMix 14.5 μL，引物各0.6 μmol/L，三蒸水10.5 μL，PCR扩增反应95℃预变性3 min，94℃变性30 s，70℃退火30 s，72℃延伸90 s，共计30个循环，最后采用73℃延伸4.5 min。对于ERβ基因AluⅠ片段选择的PCR扩增条件为反应总体系25 μL，其中含有血基因组DNA 0.1 μg，2× MasterMix 12.5 μL，引物各0.6 μmol/L，三蒸水9.5 μL，PCR扩增反应95℃预变性2.5 min，95℃变性30 s，56℃退火45 s，73℃延伸60 s，共计30个循环，最后采用73℃延伸5 min。取PCR产物10 μL，在2%琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙锭染色，紫外线透射仪观察PCR扩增是否成功，鉴定其特异性。（5）限制性酶切分析ERα和ERβ基因。分别取PCR产物10 μL，采用12 U PvuⅡ、20 U XbaⅠ以及10 U RsaⅠ、AluⅠ于37℃酶切3.5 h，反应终止后所得产物经2%或3%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色25 min，紫外线透射仪观察各基因片段的结果。使用PvuⅡ酶切分出3种基因，PP型终产物为1条带（1 300 bp）、pp型终产物2条带（分别在450 bp和850 bp）、Pp型终产物为3条带（分别在450 bp、850 bp和1 300 bp），XbaⅠ酶切可以区分3种基因，即XX型终产物1条带（1 300 bp）、xx型终产物2条带（分别在310 bp和930 bp）、Xx型终产物为3条带（分别在310 bp、930 bp和1 300 bp），其中P、X表示基因片段中出现点突变而导致酶切位点消失，p、x则存在该片段的酶切位点。

1.3统计学方法采用SPSS 17.0统计软件进行处理。等位基因频率和基因型采用基因计算法统计，采用四格表χ2检验检测研究对象与Hardy-Weinberg平衡的符合程度、单个基因型和各组间等位基因频率，采用R×C列联表χ2检验检测不同组间ER基因频率，采用比值比（OR值）和95%可信区间（95%CI）确定危险度，采用Spearman等级相关性分析ER免疫组化结果与黄褐斑严重程度的相关性。计数资料组间比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1免疫组化结果病例组部分真皮纤维细胞和血管内皮细胞中ERα和ERβ呈阳性表达，而对照组则表达较弱，见图1。

A：对照组ERα表达；B：病例组ERα表达；C：对照组ERβ表达；D：病例组ERβ表达Fig.1　Immunohistochemical staining results（×400）图1　免疫组化染色结果（×400）

2.2病例组ER蛋白表达与黄褐斑评分的关系病例组ERα和ERβ表达程度为（+）、（++）所占比例明显高于其他各表达程度组。ERα和Erβ表达程度与黄褐斑评分均呈正相关（rs分别为0.462和0.512，P＜0.05），见表1。

Tab.1　The relationship between the expression of ER protein and the score of the yellow brown spot in the case group表1　病例组ER蛋白表达与黄褐斑评分的关系

2.3ERα和ERβ基因型分析ERα基因型分析，见图2A。ERβ基因型分析，使用RsaⅠ酶切分出3种基因，rr型终产物为1条带（156 bp）、Rr型终产物3条带（分别在156 bp、125 bp和31 bp）、RR型终产物为2条带（分别在125 bp和31 bp），见图2B。AluⅠ酶切可以区分3种基因，即aa型终产物1条带（307 bp）、Aa型终产物3条带（分别在307 bp、240 bp和67 bp）、AA型终产物为2条带（分别在240 bp 和67 bp），其中R、A表示基因片段中出现点突变而出现的酶切位点，r、a表示为野生型，不存在该片段的酶切位点，见图2C。

2.42组中ERα和ERβ不同基因型的比较经Hardy-Weinberg平衡检验病例组和对照组各基因型达到遗传平衡（P＞0.05），具有群体代表性，见表2。ERα基因PvuⅡ基因型在2组中分布差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。XbaⅠ基因型在2组中分布差异有统计学意义（P＜0.05），以xx基因型为参照，暴露于X等位基因（Xx+XX）的OR值为2.23，见表4。ERβ基因AluⅠ基因型在2组中分布差异有统计学意义（P＜0.05），以aa基因型为参照，暴露于A等位基因（AA+Aa）的OR值为1.58，见表5。RsaⅠ基因型在2组中分布差异有统计学意义（P＜0.05），以rr基因型为参照，暴露于R等位基因（RR+Rr）的OR值为2.37，见表6。

Fig.2　Electrophoresis results of ER alpha and ER beta genes图2　ERα和ERβ基因分析电泳结果

Tab.2　Hardy-Weinberg balance test results of ER alpha and ER beta genes表2　ERα和ERβ基因的Hardy-Weinberg平衡检测结果

Tab.3　ER alpha gene PvuⅡin control group and case group表3　对照组与病例组ERα基因PvuⅡ基因型

Tab.4　ER alpha gene XbaⅠin control group and case group表4　对照组与病例组ERα基因XbaⅠ基因型

Tab.5　ER beta gene AluⅠin control group and case group表5　对照组与病例组ERβ基因AluⅠ基因型

Tab.6　ER beta gene RsaⅠin control group and case group表6　对照组与病例组ERβ基因RsaⅠ基因型

3　讨论

黄褐斑是临床上较为常见的获得性色素增加性皮肤病之一，在亚洲人群中其发病的部位多在下眼睑、鼻根部以及面部颧颊处，该病发病率极高，且多发于中青年女性［7］。由于其发病的部位在面部，严重影响美观，以致影响患者生活和工作的质量。黄褐斑的发生与机体内分泌失调、激素水平紊乱、激素注射以及睡眠质量不佳等有一定的关系。目前，ER在骨质疏松、肿瘤以及心血管疾病的发生发展中的作用已经明确。ER具有抑制皮脂腺分泌和促进黑色素细胞增殖的作用［8］。研究显示，ERα、ERβ共同分布在皮脂腺单元中，发挥相互协同作用，还具有加深皮肤色泽促进黑色素细胞增殖的作用［9］。黑色素细胞通过酪氨酸-酪氨酸酶等一系列的生化反应形成黑色素，女性妊娠期、月经紊乱、性生活不协调以及精神状态较为压抑时，ER出现较大的变化，接触谷胱甘肽或者硫氢基对酪氨酸的抑制作用，从而导致黑色素的增加。也有研究显示，β-雌二醇可呈剂量依赖性增加酪氨酸酶活性。ER与黄褐斑的发生明确相关，其中ERβ与黄褐斑色素严重程度明确相关［10］。本研究除印证了ERβ与黄褐斑的发病有关，也初步证实ERα与黄褐斑的发病存在一定的关系。

基因多态性是人类基因组中一个较为常见的现象，机体基因片段的某些位点出现基因多态性则对基因的转录以及基因产物的表达、功能等均产生较大的影响。目前关于雌激素受体基因多态性与黄褐斑的发病关系研究报道较少［11］。有研究指出，ERα基因在1号内含子有两处可发生突变，此处突变在限制性内切酶PvuⅡ的识别位点，另一处则在离PvuⅡ多态性位点50 bp处，可被限制性内切酶XbaⅠ识别［12］。不同基因型有可能决定不同个体之间ER的表达水平与功能差异。有研究显示，ER水平高低与黄褐斑的发病无明显关系［13］。本研究结果显示，ERα基因XbaⅠ基因型、ERβ基因AluⅠ、RsaⅠ在对照组和病例组中分布差异有统计学意义。ERα基因XbaⅠ基因型中X等位基因是xx基因型的2.23倍，ERβ基因AluⅠ基因型中A等位基因是aa基因型的1.58倍，而RsaⅠ基因型R等位基因是rr基因型的2.37倍，这些说明X、A以及R等位基因可能是黄褐斑发病的易感基因。综上，黄褐斑的发病与ERα基因XbaⅠ基因型、ERβ基因AluⅠ、RsaⅠ基因型多态性有关，突变基因增加了黄褐斑发病的风险，其中Xx、Aa和RR基因型易患病。

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（2015-11-06收稿2016-02-29修回）

（本文编辑魏杰）

中图分类号：R758.4+2

文献标志码：A

DOI：10.11958/20150292

The relationship between the incidence of melasma and estrogen gene polymorphism

BAI Zhao
Skin Surgery,The Affiliated Hospital of Tianjin Traditional Chinese Medicine Research Institute of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300120,China

Abstract:ObjectiveTo investigate the relationship between estrogen gene polymorphism and the incidence of melasma.MethodsA total of 56 patients with chloasma blepharoplasty surgery(case group)and 39 healthy women with eyelid blepharoplasty(control group)were included in this study.The expression of estrogen receptor(ER)was detected by immunohistochemistry.The ERα gene PvuⅡand XbaⅠrestriction site polymorphisms and RsaⅠand AluⅠrestriction sitepolymorphism of ERβ gene were detected by PCR-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP)analysis in two groups.The relationship between the incidence of ER and the score of melasma was analysed.ResultsResults of immunohistochemistry showed that there were positive expressions of ERα and ERβ in dermal fibroblasts and endothelial cells of case group,while there was weak expressions of ERα and ERβ in control group.Spearman correlation analysis showed that there was a positive correlation between ERα,ERβ and melasma score(rs=0.462 and 0.512,P＜0.05).There was a significant difference in distribution of ERα gene XbaⅠgenotype between two groups(P＜0.05).With xx genotype reference,the value of OR exposed to X allele(Xx+XX)was 2.23(95%CI:1.41-3.89,P＜0.05).There was a significant difference in ERβ gene AluⅠ genotypes between two groups(P＜0.05).With aa genotype reference,the value of OR exposed to the A allele(AA+Aa)was 1.58(95%CI:1.21-4.29,P＜0.05).There was a significant difference in RsaⅠgenotype distribution between two groups(P＜0.05).With reference rr genotype,the value of OR exposed to R allele(RR+ Rr)was 2.37(95%CI:1.19-6.33,P＜0.05).ConclusionThe incidence of melasma is related with XbaⅠERα genotype, ERβ gene AluⅠ,RsaⅠgenotype polymorphisms.The gene mutations increase the risk of incidence of melasma.Persons with Xx,Aa and RR genotypes are susceptible to melasma.

作者单位：天津中医药研究院附属医院皮肤外科（邮编300120）

作者简介：白朝（1969），男，副主任医师，博士，主要从事色素性皮肤病及临床治疗方面研究

Key words:melanosis;estrogen receptor alpha;estrogen receptor beta;polymorphism,genetic;chloasma