hsa-miR-144在食管鳞癌中的表达及临床意义

刘尚国，秦秀广，赵宝生△，王天云，齐博，李汉臣

hsa-miR-144在食管鳞癌中的表达及临床意义

刘尚国1，秦秀广1，赵宝生1△，王天云2，齐博1，李汉臣1

摘要：目的探讨hsa-miR-144在食管鳞癌中的表达情况及其与食管鳞癌临床病理特征及预后的关系。方法采用荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）对46例食管鳞癌及癌旁正常组织中的hsa-miR-144进行检测。考察hsa-miR-144在食管鳞癌中的表达情况及其在不同性别、年龄、肿瘤大小等临床病理特征中表达水平的差异。分析hsa-miR-144表达与食管鳞癌患者预后间的关系。Kaplan-Meier法和Log-rank考察不同临床病理特征的预后生存率差异。结果hsa-miR-144在食管鳞癌组织中的相对表达量0.97（0.22，24.48）×10-6低于癌旁正常组织8.60 （0.09，258.20）×10-6（Z=2.221，P<0.05）。在食管鳞癌组织中，hsa-miR-144的表达水平淋巴结无转移者高于有转移者；且随着病理分期的升高其表达水平降低（P<0.05），而在性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、肿瘤分化程度、肿瘤浸润深度中差异无统计学意义（均P＞0.05）。hsa-miR-144表达与食管鳞癌患者生存时间不存在相关性（rs=0.031，P= 0.839）。hsa-miR-144高表达组与低表达组的生存时间差异无统计学意义；淋巴结有转移者生存情况较无转移者差，浸润深度较深和病理分期较高者生存情况较差（P＜0.05）。结论hsa-miR-144在食管鳞癌组织中表达下调，与食管癌的淋巴结转移及病理分期有关，hsa-miR-144在食管鳞癌的发生及发展中可能起着抑癌基因作用。

关键词：逆转录聚合酶链反应；预后；因素分析；统计学；hsa-miR-144；食管鳞癌

基金项目：新乡医学院重点研究领域招标课题资助项目（ZD2011-8）

作者单位：1新乡医学院第一附属医院胸外科（邮编453100）；2新乡医学院

作者简介：刘尚国（1969），男，硕士，主要从事食管癌疾病的研究

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通讯作者E-mail:drbszhao@163.com

食管癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，发病率高，预后差。miRNAs是近年来新发现的一类内源性非编码小RNA，在肿瘤的发生、发展过程中起着癌基因或抑癌基因的作用，miRNAs表达失调与食管癌的发生、发展密切相关［1］。人类基因组编码了超过1 000个miRNAs［2］。笔者前期研究发现了包括hsa-miR-144在内的770个miRNAs食管癌表达谱［3］。目前，有关hsa-miR-144在人类食管癌中的研究尚少见相关报道。本研究旨在应用荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）对食管鳞癌组织中的hsa-miR-144进行检测，分析其与食管鳞癌病理特征及预后的关系。

1　资料与方法

1.1一般资料收集2006年9月—2009年12月于新乡医学院第一附属医院胸外科行手术切除的食管鳞癌标本46例，男23例，女23例，年龄45～73岁，中位年龄59岁，均经2名高年资病理医师确定。纳入标准：临床病理资料及术后随访资料完整，术后病理证实为食管鳞癌，术前未接受放射治疗或化学治疗。肿瘤>5 cm者19例，≤5 cm者27例；高、中及低分化者分别为11、19、16例；淋巴结有转移者19例，无转移者27例；浸润深度达黏膜层者（Tis，T1）8例，肌肉层者（T2）6例，外膜者（T3）32例；肿瘤位于胸上段者4例，胸中段者35例，胸下段者7例；术后TNM病理分期0～Ⅰ期者7例，Ⅱa～Ⅱb期者21例，Ⅲ期者18例。取对应的距肿瘤边缘5 cm以上的癌旁正常食管黏膜组织（组织病理切片证实）作对照。

1.2RT-PCR检测hsa-miR-144的相对表达量 （1）提取RNA。采用Trizol一步法提取食管鳞癌组织细胞中的总RNA，操作按照RNA提取试剂盒（Invitrogen，USA）说明书进行。分光光度计分别测定波长230、260及280 nm处的吸光度值，确定总RNA的纯度和浓度。甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测总RNA样品中28 s和18 s的比例，鉴定其纯度和完整性。（2）反转录。采用Taqman miRNAs反转录试剂盒和miRNAs特异性茎环结构（stem-loop）反转录引物进行反转录反应。将反转录体系混匀，1 200 r/min离心2次，每次1 min。加入3 μL总RNA。反转录条件：16℃孵育2 min，42℃反应1 min，50℃反应1 s，40个循环，再85℃孵育5 min，4℃终止反应。反转录产物置于冰上备用。（3）预扩增。将PCR反应体系混匀，1 200 r/min离心2次，每次1 min。反应条件：95℃10 min，55℃、72℃分别反应2 min，95℃15 s，60℃40 min，12个循环，99.9℃孵育10 min。加入0.1×TE （pH8.0）75 μL，混匀，-20℃保存备用。（4）相对表达量测定。漩涡混匀TaqMan®通用PCR预混PCR反应液。PCR反应体系包括450 μL 2×TaqMan®通用PCR预混反应液、9 μL Pre⁃Amp产物、441 μL无核酸酶水，共900 μL。hsa-miR-144荧光定量PCR引物，将PCR反应体系混匀，1 200 r/min离心2次，每次1 min。在Taqman miRNA Array的每个孔中加100 μL PCR反应混合液，1 200 r/min离心2次，每次1 min。反应条件：94.5℃反应10 min，97℃30 s，59.7℃1 min，40个循环反应。以U6 snRNA管家基因作为内参，相对定量法计算基因的表达量，以2-△△ct表示。

1.3结果判断考察hsa-miR-144在食管鳞癌中的表达情况及其在不同性别、年龄、肿瘤大小等临床病理特征中的表达差异。分析hsa-miR-144表达水平与食管鳞癌患者预后生存时间的关系。生存期为食管癌手术后至患者死亡或随访截止日期的时间。随访时间2006年9月—2014年9月，1～96个月。至随访截止日，31例死亡，13例生存。

1.4统计学方法采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析。不符合正态分布的数据采用M（P25，P75）表示，2组间数据比较用Mann-Whitney U检验，多组间比较用Kruskal-Wallis H检验。hsa-miR-144表达与食管鳞癌患者预后间的关系采用Spearman等级相关分析。生存分析采用Kaplan-Meier法和Log-rank检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1hsa-miR-144在食管鳞癌中的表达hsamiR-144 cDNA Ct值为27～39，PCR扩增效率理想，hsa-miR-144在食管鳞癌组织中的相对表达量0.97（0.22，24.48）×10-6低于癌旁正常组织中的表达量8.60（0.09，258.20）×10-6（Z=2.221，P<0.05）。

2.2hsa-miR-144表达与食管鳞癌临床病理特征的关系在食管鳞癌组织中，hsa-miR-144的表达水平淋巴结无转移者高于有转移者，且随着病理分期的升高其表达水平降低（P<0.05），而在不同性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、肿瘤分化程度、肿瘤浸润深度中差异无统计学意义（均P＞0.05），见表1。

2.3hsa-miR-144表达与食管鳞癌患者预后的关系hsa-miR-144表达水平与食管鳞癌患者预后之间不存在相关性（rs=0.031，P=0.839）。

2.4不同病理特征的预后生存率分析hsa-miR-144高表达组与低表达组生存率差异无统计学意义；但淋巴结有转移者生存情况较无转移者差，浸润深度较深和病理分期较高者生存情况较差（P＜0.05），见表1。

3　讨论

食管癌的发生是一个复杂的过程，目前其临床治疗仍以手术、放疗及化疗等为主，但存活率较低。从基因水平寻找特定的生物标志物，建立有效的早期预防及诊断方法成为当今肿瘤研究的热点［4］。近年来随着miRNAs的发现，miRNAs与食管癌组织类型、分期和预后等的关系，以及miRNAs对食管癌细胞增殖、转移和浸润的调控机制研究受到关注［5］。

miRNAs是一类长度为21～25个核苷酸非编码的单链RNA分子。通常情况下，几乎在所有的肿瘤中均有miRNAs异常表达，相关基因参与体内基本信号传导途径，通过调节mRNA的翻译而调控许多重要肿瘤相关基因的表达。研究显示，在食管癌中表达异常的miRNAs有has-miR-205、has-miR-335、has-miR-181d、has-miR-25、has-miR-7、hasmiR-495、hsa-miR-126及hsa-miR-518b［6-8］。另有研究显示，近年来食管腺癌的发病率在欧美等西方国家显著上升，我国食管癌则一直以食管鳞癌为主，食管腺癌的发病率未见明显增长［9］。

近年来研究已证实，循环中的miRNAs以稳定的形式存在于血浆、尿液等体液中，可以作为疾病特异、敏感的生物标志物［10］。相关研究证实，hsamiR-144参与结肠癌［11］、直肠癌［12］、甲状腺癌［13］等多种肿瘤的发生与发展，这为肿瘤的诊断提供了一种可定量、非侵入性的新方法。在食管癌方面，Xie等［14］研究发现，食管癌患者唾液中可检测出miR-144、miR-21等6种miRNAs，而他们有可能是食管癌的潜在生物标志物。本研究显示，hsa-miR-144在食管鳞癌组织中的表达量低于癌旁正常组织，推测hsa-miR-144在食管鳞癌的发生中亦可能起着抑癌基因的作用。此外，hsa-miR-144在淋巴结无转移者中的表达量高于有转移者；且其表达量随着病理分期的升高而降低，提示hsa-miR-144在食管癌的进展及转移过程中可能起着抑癌基因作用。

Tab.1　Comparison of relationship between expression of hsa-miR-144 and clinicopathological features in patients with esophageal squamous cell carcinoma表1　不同临床病理特征的食管鳞癌患者hsa-miR-144表达及生存时间的比较

Guo等［7］通过对31对原发食管鳞状上皮癌组织和临近正常组织进行分析发现，miR-103的低表达和食管癌患者较高的生存率相关。Ogawa等［15］发现，miR-129过度表达与食管鳞癌低生存率密切相关。目前，国内外尚少见有关hsa-miR-144表达与食管癌预后关系的研究。本研究结果显示，hsamiR-144表达与食管鳞癌患者预后不存在相关性，hsa-miR-144高表达组与低表达组生存率差异无统计学意义，分析原因可能与本研究患者治疗方案均为手术切除，而食管癌患者的预后受一般状况、病理分期及治疗方案等多种因素影响。

综上所述，hsa-miR-144在食管鳞癌中表达下调，并与食管鳞癌的淋巴结转移和病理分期有关，但确切作用机制仍需要进一步研究。开展对hsamiR-144的功能研究将为诊断、治疗和预防食管鳞癌提供重要的参考依据。

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（2015-09-02收稿2016-01-25修回）

（本文编辑陆荣展）

中图分类号：R735.1

文献标志码：A

DOI：10.11958/20150122

The expression and clinical significance of hsa-miR-144 in esophageal squamous cell carcinoma

LIU Shangguo1,QIN Xiuguang1,ZHAO Baosheng1△,WANG Tianyun2,QI Bo1，LI Hanchen1
1 Department of Thoracic Surgery,the First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University, Xinxiang 453100,China;2 Xinxiang Medical University
△Corresponding AuthorE-mail:drbszhao@163.com

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression of hsa-miR-144 in esophageal squamous cell carcinoma,and its relationship with clinicopathological features and prognosis.MethodsReverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)method was used to detect the hsa-miR-144 in 46 cases of esophageal squamous cell carcinoma and adjacent normal tissue.The expression of hsa-miR-144 in esophageal squamous cell carcinoma and its difference in the clinicopatho⁃logical characteristics including gender,age,and tumor size were investigated.The relationship between the expression of hsa-miR-144 and prognosis of patients with esophageal squamous cell carcinoma was analyzed.Kaplan-Meier method and Log-rank test were used to analyse the differences in survival rates in different pathological characteristics.ResultsThe ex⁃pression level of hsa-miR-144 was lower in esophageal squamous cell carcinoma0.97(0.22-24.48)×10-6than that of adjacent normal tissue 8.60(0.09-258.20)×10-6,the difference was statistically significant(Z=2.221,P<0.05).The expression level of hsa-miR-144 was higher in esophageal squamous cell carcinoma with no lymph node metastasis than that in esophageal squa⁃mous cell carcinoma with lymph node metastasis(Z=2.758，P<0.05),and the expression level decreased with the increase in the pathological staging(Z=7.737，P<0.05).There were no significant differences in the expression levels of hsa-miR-144 between different gender,age,tumor size,tumor location,tumor differentiation and tumor invasion depth(all P＞0.05).There was no correlation between the expression of hsa-miR-144 and prognosis in patients with esophageal squamous cell carcino⁃ma(rs=0.031,P=0.839).In the survival rate,there was no statistic significance between high expressive of hsa-miR-144 group and low expressive group(P=0.828).The survival rate was lower in patients with lymph node metastasis than that of pa⁃tients without lymph node metastasis.The survival rates were lower in patients with relatively deep invasion and higher patho⁃logic stage(P＜0.05).ConclusionThe expression of hsa-miR-144 is down regulated in esophageal squamous cell carcino⁃ma,and which is associated with lymph node metastasis and pathological staging of esophageal carcinoma.It shows that hsamiR-144 may serve as an anti-oncogene in the occurrence and development of esophageal squamous cell carcinoma.

Key words:reverse transcriptase polymerase chain reaction;prognosis;factor analysis;statistical;hsa-miR-144; esophageal squamous cell carcinoma