小儿止咳颗粒对哮喘大鼠气道炎症的免疫调控作用研究

刘映玲　郑艳萍　黄慧芳　郑　敏　许双虹　深圳市中医院　518033　广东深圳市福华路1号

·实验研究·

小儿止咳颗粒对哮喘大鼠气道炎症的免疫调控作用研究

刘映玲郑艳萍黄慧芳郑敏许双虹深圳市中医院518033广东深圳市福华路1号

摘要目的：观察小儿止咳颗粒对哮喘模型大鼠血清与肺泡灌洗液中白三烯C4（LTC-4）、干扰素-γ （IFN-γ）、白介素-4（IL-4）、白介素-5（IL-5）的影响，从而探讨其治疗咳嗽变异性哮喘的作用机制。方法：36只SD雌性大鼠随机分为6组：空白对照组，模型组，地塞米松组，小儿止咳颗粒低、中、高剂量组，每组6只。除空白对照组外，余组均采用鸡卵白蛋白（OVA）致敏并反复多次激发的方法建立大鼠哮喘模型。从腹腔注射OVA氢氧化铝悬液致敏第15天起行雾化激发，在雾化激发前模型组以10 ml/kg生理盐水灌胃，地塞米松组以0.3 mg/kg地塞米松溶液灌胃，小儿止咳颗粒低、中、高剂量组分别以12.5 g/kg、25 g/kg、50 g/kg小儿止咳颗粒溶液灌胃。空白对照组以10 ml/kg生理盐水灌胃。治疗结束后收集血清及肺泡灌洗液（BALF），运用酶联免疫吸附（ELISA）法检测各组血清及肺泡灌洗液中LTC-4以及IFN-γ、IL-4、IL-5的含量。结果：①与空白对照组比较，模型组大鼠体重明显下降（P＜0.01）；而地塞米松组及小儿止咳颗粒各剂量组大鼠体重均较模型组有显著提升（P＜0.01）。②与空白对照组比较，模型组大鼠中血清LTC-4水平显著升高，IFN-γ水平显著降低（均P＜0.01），而血清IL-4与IL-5无明显变化；地塞米松与小儿止咳颗粒各剂量均可降低模型大鼠血清中LTC-4水平（P＜0.01），高剂量组改善程度优于地塞米松组（P＜0.01）；高剂量组可明显提升模型大鼠血清中IFN-γ水平，与模型组、地塞米松组比较均有显著性差异（P＜0.01）。③与空白对照组比较，模型组大鼠BALF中LTC-4、IL-4与IL-5水平显著升高（P＜0.01），IFN-γ水平显著下降（P＜0.01）；地塞米松与小儿止咳颗粒各剂量均可下调LTC-4、IL-4水平（P＜0.05或P＜0.01），小儿止咳颗粒各剂量组均可上调模型大鼠BALF中的INF-γ水平（P＜0.01）；地塞米松与小儿止咳颗粒中、高剂量可下调BALF中IL-5水平（P＜0.01）。结论：小儿止咳颗粒治疗咳嗽变异性哮喘可能是通过下调炎症介质表达，改善免疫紊乱，从而减轻气道炎症而实现的。

关键词哮喘大鼠；气道炎症；免疫调控；小儿止咳颗粒；中医药疗法

咳嗽变异性哮喘（Cough Variant Asthma，CVA）为学龄前期和学龄期儿童常见的呼吸系统疾病，又称咳嗽型哮喘，是指以慢性咳嗽为主要或唯一临床表现的一种特殊类型支气管哮喘，其主要发病机制与细胞免疫失衡、气道慢性炎症形成密切相关［1-2］。小儿止咳颗粒是我院儿科治疗小儿咳嗽变异性哮喘的常用中药制剂，临床疗效显著。本实验通过观察小儿止咳颗粒对哮喘模型大鼠血清与肺泡灌洗液中炎症介质白三烯C4（LTC-4）以及细胞因子干扰素-γ（IFN-γ）、白介素-4（IL-4）、白介素-5（IL-5）的影响，来探讨小儿止咳颗粒对咳嗽变异性哮喘气道炎症的免疫调控作用。现将结果报道如下。

1　材料与方法

1.1动物健康SD雌性大鼠36只，体重180～200 g，SPF级，由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号：0074582。

1.2药物与试剂小儿止咳颗粒（百部、紫菀、款冬花、桔梗、荆芥、牛蒡子、枳壳、陈皮、茯苓、甘草等），由深圳市中医院制剂室制备（粤药制字011220），每包10 g。地塞米松溶液购自南京森贝伽生物科技有限公司，批号：100016-201216。鸡卵白蛋白（OVA）为美国Sigma公司产品，批号：A5503。ELISA试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司，LTC-4批号：CSBE08534r；IFN-γ批号：CSB-E04579r；IL-4批号：CSB-E04635r；IL-5批号：CSB-E07435r。

1.3动物模型制备36只大鼠随机分为6组：空白对照组，模型组，地塞米松组，小儿止咳颗粒低、中、高剂量组，每组6只。大鼠适应性饲养 1周后参考Palmans等［3］方法，采用OVA致敏并反复多次激发的方法建立大鼠哮喘模型。除空白对照组外，其余造模大鼠分别于第1天、第8天腹腔注射新鲜配制的OVA氢氧化铝悬液，自第15天起将大鼠置于半封闭的有机玻璃箱内进行超声雾化以激发哮喘，每次吸入1%OVA混悬液，雾化时间为30 min。哮喘激发每日1次，连续4周。以大鼠腹肌明显收缩，呼吸加深加快，急促、咳嗽，严重者呈深、慢呼吸或呼吸节律不整，行动迟滞或俯伏不动等表现为激发成功，提示造模成功［4］。空白对照组以等量生理盐水代替OVA氢氧化铝溶液腹腔注射及OVA溶液雾化吸入。

基金项目：深圳市科技创新委员会项目（编号：JCYJ20140408153413103）

1.4给药方法从腹腔注射OVA氢氧化铝悬液致敏第15天，雾化激发开始前2小时给予各组干预措施。小儿止咳颗粒以生理盐水溶解，高、中、低剂量组分别以50 g/kg、25 g/kg、12.5 g/kg（以原药计算）灌胃，灌胃容量为10 ml/kg；地塞米松组以0.3 mg/kg灌胃，灌胃容量为10 ml/kg；空白对照组和模型组以10 ml/kg生理盐水灌胃。每天1次，共给药40 d。

1.5标本采集与处理最后一次给药2 h后，摘除眼球取血，离心取上清液。取血完毕后大鼠行气管插管至右肺并结扎，用4℃生理盐水行支气管肺泡灌洗，每次3 ml，反复灌洗3次，回收率均大于50%。采用ELISA方法，按试剂盒操作，测定血清及肺泡灌洗液中LTC-4、IFN-γ、IL-4、IL-5水平。

1.6统计学处理采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析。数据检测重复3次取均值，计量资料以均数±标准差（±s）表示，用单因素方差分析（One-way ANOVA）进行统计学分析，检验水平α=0.05。以P＜0.05为有统计学意义。

2　实验结果

2.1大鼠的一般情况空白对照组大鼠表现活泼好动，饮食如常，动作灵敏，毛色光滑，呼吸平稳。模型组大鼠造模后开始出现躁动不安、搔抓、舔肢体、打喷嚏等症状，继而出现不同程度的呼吸困难症状，如张口呼吸频率及幅度增加，严重者紫绀，烦躁，同时毛色晦暗无光泽，甚至脱落，提示大鼠哮喘模型制备成功。与模型组比较，小儿止咳颗粒高、中剂量组大鼠症状明显减轻，无呼吸急促，无紫绀，大鼠毛色光泽较好，精神也较好，与地塞米松组症状缓解相当。小儿止咳颗粒的低剂量组大鼠与哮喘模型组相比较，症状稍有减轻。提示地塞米松与小儿止咳颗粒对哮喘模型大鼠的症状均有改善作用。

2.2大鼠的体重变化见表1。

表1干预前后各组大鼠体重变化情况　　（g±s）

表1干预前后各组大鼠体重变化情况　　（g±s）

注：与空白对照组比较，①P＜0.01；与模型组比较，②P＜0.01；与地塞米松组比较，③P＜0.01

组别　　干预前体重　　干预后体重　　干预前后体重差n　　剂量（g/kg）空白对照组　189.5±6.66　289.7±5.09　100.2±5.42模型组　188.8±5.91　248.7±4.76　59.8±6.31①地塞米松组　188.0±5.18　268.0±7.54　80.0±5.22②小儿止咳颗粒低剂量组　188.3±6.80　277.2±5.19　88.8±4.26②③小儿止咳颗粒中剂量组　188.8±6.43　283.8±10.93　95.0±4.82②③66666 --5 0 0.003 12.5 25小儿止咳颗粒高剂量组　189.8±4.36　288.0±8.15　98.2±6.21②③6

表1显示，40d后模型组大鼠体重明显下降，显著低于空白对照组（P＜0.01）。而地塞米松组以及小儿止咳颗粒低、中、高剂量组大鼠干预后体重增加值均明显高于模型组（均P＜0.01）；小儿止咳颗粒低、中、高剂量组大鼠体重增长均优于地塞米松组（均P＜0.01）。提示了哮喘可导致大鼠体重增加缓慢，而予地塞米松与小儿止咳颗粒治疗后可改善这种状况。

2.3小儿止咳颗粒对哮喘大鼠血清细胞因子的影响见表2。

表2　各组大鼠血清中细胞因子的水平比较　　（pg/ml，±s）

表2　各组大鼠血清中细胞因子的水平比较　　（pg/ml，±s）

注：与空白对照组比较，①P＜0.01；与模型组比较，②P＜0.01；与地塞米松组比较，③P＜0.01

组别　LTC-4　IFN-γ　IL-4　IL-5空白对照组　1264.32±230.36　182.33±6.60　89.53±7.47　67.70±2.60模型组　2103.79±123.26①　65.05±8.85①　84.48±6.02　73.30±1.96地塞米松组　1632.11±83.54②　59.67±4.29　77.08±6.78　68.40±1.11小儿止咳颗粒低剂量组　1784.48±209.29②　65.78±11.30　79.75±7.13　72.80±3.45小儿止咳颗粒中剂量组　1878.77±97.23②　70.63±10.82　76.24±6.96　68.43±1.94小儿止咳颗粒高剂量组　1086.28±23.91②③　151.83±11.40②③　78.65±6.81　67.53±2.80 n　　剂量（g/kg）6-6 -6　0.003 6　12.5 6　25 6　50

表2显示，与空白对照组比较，模型组大鼠的血清LTC-4水平显著升高（P＜0.01）；而经地塞米松以及小儿止咳颗粒低、中、高剂量干预后，模型大鼠血清LTC-4水平均明显下降（P＜0.01），其中小儿止咳颗粒高剂量组的下降水平最显著，与地塞米松组比较有显著性差异（P＜0.01），接近空白对照组水平（P＞0.05）。造模后模型组的血清IFN-γ水平较空白对照组急剧下降（P＜0.01）；地塞米松及小儿止咳颗粒中、低剂量干预对模型大鼠血清IFN-γ水平无明显影响（P＞ 0.05）；而小儿止咳颗粒高剂量组的血清IFN-γ水平显著高于模型组和地塞米松组（均P＜0.01）。各组间血清IL-4、IL-5水平比较无明显差异（均P＞0.05）。提示哮喘模型大鼠的血清LTC-4水平显著升高，IFN-γ水平显著降低，而血清IL-4与IL-5水平无明显变化；地塞米松干预可下调哮喘大鼠的血清LTC-4水平，但对血清IFN-γ水平无作用；而小儿止咳颗粒既可下调血清LTC-4水平，又可提升血清IFN-γ水平，作用强度与剂量呈正相关趋势。值得注意的是，模型组哮喘大鼠血清IL-4、IL-5水平与空白对照组比较无显著差异，推测这可能由于哮喘大鼠模型是用OVA先腹腔致敏，然后雾化吸入卵蛋白激发，其激发的免疫反应主要发生在肺组织局部，而细胞因子主要由激活的免疫细胞所分泌，在肺外组织炎症可能并不突出，故而血清中的细胞因子无显著变化。这也说明了动物哮喘模型与人类哮喘疾病仍存在较大区别。

2.4小儿止咳颗粒对哮喘大鼠肺泡灌洗液中细胞因子的影响见表3。

表3　各组大鼠BALF中细胞因子的水平比较　（pg/ml±s）

表3　各组大鼠BALF中细胞因子的水平比较　（pg/ml±s）

注：与空白对照组比较，①P＜0.01；与模型组比较，②P＜0.05，③P＜0.01；与地塞米松组比较，④P＜0.01

组别　LTC-4　IFN-γ　IL-4　IL-5空白对照组　381.22±65.97　34.19±5.00　23.64±1.86　68.49±4.46模型组　970.45±10.86①　18.19±4.34①　46.62±6.35①　170.45±10.86①地塞米松组　485.08±58.22③　19.48±0.73　38.98±0.45②　115.08±3.54③小儿止咳颗粒低剂量组　856.89±24.14③　33.48±2.62③④　33.32±2.63③④　176.33±6.00小儿止咳颗粒中剂量组　713.00±80.45③　36.74±1.15③④　30.83±0.78③④　132.23±10.01③小儿止咳颗粒高剂量组　349.27±74.52③④　42.57±3.74③④　27.80±2.12③④　89.63±6.01③④n　　剂量（g/kg）6-6-6　0.003 6　12.5 6　25 6　50

表3显示，与空白对照组比较，模型组大鼠BALF中LTC-4水平明显升高（P＜0.01）；而经地塞米松以及小儿止咳颗粒低、中、高剂量干预后则显著降低（P＜0.01），LTC-4下降幅度与小儿止咳颗粒的剂量呈正相关趋势，剂量越大LTC-4水平下降越显著，其中高剂量组与地塞米松组比较有显著性差异（P＜0.01），并接近空白对照组水平（P＞0.05）。模型组BALF中IFN-γ水平较空白对照组显著下降（P＜0.01），但地塞米松对模型大鼠BALF中IFN-γ水平无改善作用（P＞0.05）；小儿止咳颗粒低、中、高各剂量干预均可明显升高模型大鼠BALF中的IFN-γ水平（P＜0.01），均显著优于地塞米松组（P＜0.01），并呈剂量依赖趋势。模型组大鼠BALF中IL-4水平较空白对照组显著升高（P＜0.01）；经地塞米松和小儿止咳颗粒各剂量干预后则有显著下降（P＜0.05或P＜0.01），IL-4下降幅度与剂量呈正相关趋势，低、中、高各剂量组均优于地塞米松组（P＜0.01）。在IL-5水平方面，模型组IL-5水平明显高于空白对照组（P＜0.01），经地塞米松和小儿止咳颗粒中、高剂量组干预后下降明显（均P＜0.01）；其中高剂量组优于地塞米松组（P＜0.01）。提示哮喘模型大鼠的BALF中LTC-4、IL-4与 IL-5水平显著升高，而IFN-γ水平显著降低；地塞米松干预可下调哮喘大鼠 BALF中的LTC-4、IL-4与IL-5水平，但对IFN-γ无作用；而小儿止咳颗粒既可下调哮喘大鼠BALF中的LTC-4、IL-4与IL-5水平，又可提升IFN-γ水平，作用强度与剂量呈正相关趋势。

3　讨论

CVA一般情况下无支气管哮喘常见的喘息、气促等呼吸困难症状，而多以持续或反复发作的咳嗽为主要表现，但CVA可发展为典型哮喘。诸多研究证实了CVA与支气管哮喘有类似的病理生理特征［1-2，5］。支气管哮喘是一种由多种细胞和细胞因子参与的气道慢性炎症［6］。白三烯已经被证实是参与哮喘发病最重要的炎症介质之一，能直接引起支气管平滑肌强烈收缩，导致炎症细胞在气道大量聚集［7］。而白三烯C4（LTC-4）是体内白三烯的主要组成部分，参与哮喘发病过程的多个环节［8］。因此，通过LTC-4可推断气道炎症情况。Th1/Th2失衡是支气管哮喘的重要发病机制［5，9］。Th1主要介导细胞免疫和炎症反应，通过释放IFN-γ、IL-2、IL-3、TNF-β等细胞因子产生免疫应答，抑制哮喘病理过程；Th2主要参与B细胞增殖、抗体产生与速发型超敏反应，分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-13和GM-CSF等细胞因子，影响T细胞分化，参与哮喘的气道炎症的形成［10］。由此可见，Th1占优势时，炎症局限，预后良好；Th2占优势时，炎症扩散，预后不良［11］。在哮喘发病时，Th1细胞因子免疫反应减弱，Th2细胞因子免疫反应则异常增强。

CVA可归属于中医“咳嗽”范畴，其咳嗽症状呈阵发性、忽发忽止、反复性发作、受风加剧、多伴咽痒等特点。考虑到患儿稚阴稚阳之体，我们主张CVA的用药宜温润平和，重在理肺止咳，复其肃降，略兼疏散风邪，因而采用小儿止咳颗粒治疗。方中以百部、紫菀为君，两药均温润，不寒不热，药性温和，符合小儿稚阴稚阳的体质特点，有较好的止咳化痰功效，为常用止咳药物；款冬花化痰降气止咳，桔梗宣肺利咽化痰，二者一宣一降，以正肺气，增强化痰止咳之功，为臣药；荆芥疏风解表利咽，牛蒡子疏风宣肺利咽，枳壳降气，陈皮理气化痰，茯苓渗湿健脾以绝痰之化源，均为佐药；甘草缓急和中，调和诸药，又合桔梗利咽，为佐使之用。全方共奏化痰止咳、疏风利咽之效。经我院临床应用多年，疗效显著。

本实验研究结果提示：小儿止咳颗粒可显著下调哮喘大鼠血清和肺泡灌洗液（BALF）中LTC-4的表达，从而直接减轻气道炎症；显著上调血清和肺泡灌洗液（BALF）中Th1型细胞因子IFN-γ的表达，同时下调BALF中的Th2型细胞因子IL-4和IL-5的表达，从而改善Th1/Th2失衡状态；其作用强度与剂量呈正相关趋势。提示小儿止咳颗粒治疗咳嗽变异性哮喘的作用可能是通过下调炎症介质表达，改善免疫紊乱，从而减轻气道炎症等机制实现的。

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（2016-03-03收稿/编辑陈明伟）

中图分类号：R285.5

文献标识码：A

文章编号：1003-0719（2016）03-0067-04