5-甲基胞嘧啶互变异构体热力学稳定性及质子迁移机理的理论研究

靳玲侠，杨佳红，李 琛，闵锁田，魏雅雯

研究与开发

5-甲基胞嘧啶互变异构体热力学稳定性及质子迁移机理的理论研究

靳玲侠1，杨佳红1，李 琛1，闵锁田1，魏雅雯2

（1.陕西理工学院化学与环境科学学院，陕西省催化基础与应用重点实验室，陕西 汉中 723001；2.长安大学出版科学研究所，陕西 西安710064 ）

采用密度泛函理论，在B3LYP/6-31++G//B3LYP/6-31G基组水平上对5-甲基胞嘧啶互变异构体及质子转移机理进行了研究，获得了10种5-甲基胞嘧啶互变异构体及12个异构化过渡态，并获得了互变异构过程的反应焓、活化能、活化吉布斯自由能和质子转移反应的速率常数等性质。计算结果表明，5-甲基胞嘧啶各互变异构体的相对热力学稳定性为：M1＞M3＞M4＞M5＞M6＞M2＞M7＞M8＞M9＞M10。其中氨-酮式结构M1能量最低，稳定性最高；亚氨-烯醇式结构M10相对能量最高，稳定性最低。在5-甲基胞嘧啶的异构化过程中，部分异构体之间可以相互转化，其中键旋转较质子迁移所需活化能较低，反应较易实现。由氨酮式M1通过分子内质子迁移及键旋转异构转化共有6条反应通道，其主通道（5）速控步骤的活化能为163.81 kJ·mol-1，反应较难实现。

5-甲基胞嘧啶；密度泛函理论方法；互变异构；过渡态

由于生物体内碱基分子普遍存在互变异构现象，且这种互变异构是发生变异的基础，使得生物体内这种互变异构现象成为近年来生物医学领域的研究热点之一［1-2］。核酸5种碱基中的酮基和氨基，均位于碱基环中氮原子的邻位， 可以发生酮式、烯醇式或氨基、亚氨基之间的结构互变，这种互变异构在基因的突变和生物的进化中具有重要作用［3-4］。

实验研究表明［5-6］，DNA链上某些分子片段的甲基化对抑制基因表达、维持染色体结构、X染色体失活、基因印记及肿瘤的发生等有着重要影响。在真核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶（5-MeCyt）是唯一存在的化学性修饰碱基，是稀有碱基的一种形式，是胞嘧啶残基的重要组成之一。5-MeCyt在DNA链上明显地去甲基化或者去氨基生成胞嘧啶或胸腺嘧啶，从而引发基因突变，导致人类发生许多的病变［7］。

文献报道［8］，Adamowicz等采用红外光谱法对该化合物异构体的稳定性以及在气相中的互变异构现象进行了研究，证明在惰性气体中该化合物主要以4种互变异构体形式存在，其中包括烯醇式-亚胺式、烯醇式-氨基式、酮式-氨基式。5-MeCyt通过分子内H迁移可形成酮式-醇式多种互变异构体，而不同异构体都可以与其它碱基发生配对。由于对含量低于0.1%～1.0%的异构体，实验上很难检测到［9］，在碱基对复制过程中，异构体含量在10-8～10-11即会发生自发变异，导致遗传变异异构体的浓度比实验可检测到的最低浓度还要低若干个数量级，因此，用实验方法直接检测导致碱基对错配的微量异构体形式，研究异构体的相互转化机理比较困难。尽管Sambroano等采用DFT方法已经研究了7种5-MeCyt异构体的稳定性及3对互变异构现象［10］，但遗憾的是，到目前为止，还未见关于5-MeCyt烯醇式-亚胺式、烯醇式-氨基式、酮式-氨基式互变异构动力学机理理论研究的报道。因此，从理论上研究揭示标题化合物质子转移互变异构机理及动力学性质具有重要的实际意义。本文利用密度泛函理论B3LYP方法，在6-31++G//6-31G水平上对标题化合物分子内质子转移互变异构反应动力学进行了计算研究，分别获得了5-MeCyt键旋转及质子迁移异构的反应焓、活化能、活化吉布斯自由能和速控步骤的速率常数等性质，这些理论计算结果对于5-甲基胞嘧啶性质的实验研究具有一定的参考价值。

1 计算方法

采用密度泛函B3LYP方法对质子迁移及键旋转异构化体系的研究已有不少文献报道，且取得了与实验研究极为相符的结果［11-15］。因此，本文选用B3LYP/6-31G方法，对5-甲基胞嘧啶质子迁移及互变异构化反应路径上的各驻点（反应物、产物和过渡态）的几何构型进行了全优化，通过振动频率计算对各驻点进行了确认，同时获得了零点能、总能量、热焓和吉布斯自由能，并在相同水平上进行内禀反应坐标（IRC）［16］计算，以证实反应物、过渡态和产物的相关性。全部计算采用Gaussian03程序包［17］在PIV微机上完成。

2 结果与讨论

图1给出了5-甲基胞嘧啶异构体的几何结构，各异构体的非氢原子编号是一致的，具体编号已在图中标出，以Mn （n=1～10）命名。根据图1中异构体的结构，本文设计了2种可能的反应途径：（a）键旋转异构化；（b）分子内质子迁移异构化。

图1 B3LYP/6-31G方法水平上10种5-甲基胞嘧啶异构体的几何构型（键长： Å，键角： °）

振动频率分析表明，所有异构体的振动频率均为实频，表明均为势能面上的稳定点；而所有过渡态有且仅有一个虚振动频率，表明均为势能面上的一阶鞍点，而且虚振动模式矢量展示了从一个异构体走向另一个异构体的趋势，表明图2中列出的过渡态是真实可信的。

2.1 异构体的相对稳定性

表1列出了气相5-甲基胞嘧啶异构体及过渡态总能量ET、零点能EZPE、相对能ER和异构化反应过渡态的虚频v。比较表1中10种异构体能量可知，在室温气相中，各异构体的相对稳定性为M1＞M3＞M4＞M5＞M6＞M2＞M7＞M8＞M9＞M10。其中氨-酮式结构的M1相对能量最低，稳定性最高，亚氨-烯醇式结构的M10相对能量最高，稳定性最低。次稳定的亚氨-酮式结构的相对能量为7.82 kJ·mol-1。Mezey［18］指出，当2种互变异构体的能量差值在40 kJ·mol-1以内时，其互变异构体可平衡存在于同一体系中。据此可推测，5-甲基胞嘧啶的氨-酮式结构M1与亚氨-酮式结构M3和M4、氨-烯醇式结构M5和M6、氨-酮式结构M2在气相中可平衡共存，这与Adamowicz的红外光谱法的实验结论一致。比较表1中数据还发现，4种亚氨-烯醇式结构M7、M8、M9和M10的相对能量均在70kJ·mol-1以上，可见气相时均不是稳定异构体。

2.2 键旋转异构化及质子迁移异构化机理

5-甲基胞嘧啶键旋转异构化及分子内质子迁移反应过程中涉及的各驻点物种的几何构型如图2所示。由于过渡态中氢的位置不同，因此采用HT来表示。计算结果表明，图2中所有异构体及过渡态羟基O-H上H原子在内，各原子均处在同一平面中，这种构型有利于分子内氢键形成。其中TSM5/M6、TSM3/M4、TSM7/M8和TSM9/M10属于键旋转异构化的过渡态，而TSM1/M3、TSM1/M5、TSM6/M2、TSM3/M10、TSM5/M7、TSM3/M7、TSM4/M9和TSM4/ M8属于分子内质子迁移异构化的过渡态。

表 1 5-甲基胞嘧啶体系中各驻点电子结构能量E、零点能EZPE、 总能量ET、相对能量ER及异构化反应过渡态虚频v

图2 B3LYP/6-31G方法计算得到的12个5-甲基胞嘧啶过渡态构型（键长： Å，键角： °）

在5-甲基胞嘧啶分子中，由于HT原子键连位置不同，导致5-甲基胞嘧啶存在多种异构体形式。因此，我们从5-甲基胞嘧啶异构体M1出发，研究了5-甲基胞嘧啶异构体的互变异构化过程。通过对所有可能的反应途径的尝试，找到了如下6条反应通道，分别是：

图3示出了分子内质子迁移及键旋转异构化的反应势能面剖面图。从表1和图3看出，通道（1）、（2）中第三步异构化反应M4→TSM4/M8→M8、M4→TSM4/M9→M9所需活化能均高于其它两步，是反应的速控步骤；通道（3）、（4）、（6）中第二步异构化反应M3→TSM3/M7→M7、M3→TSM3/ M10→M10、M5→TSM5/M7→M7所需活化能均高于其它两步，是反应的速控步骤；通道（5）中第一步异构化反应M1→TSM1/M5→M5所需活化能均高于其它两步，是反应的速控步骤。因此，各通道速率控制步骤的活化能分别为204.82、204.12、192.23、225.32、163.81和192.26 kJ·mol-1。通道（5）速控步骤M1→TSM1/M5→M5的活化能最低，且形成的中间体M5、M6和M2的相对能量较低，是热力学上的优势异构体。通道（1）和（2）的速控步骤所需活化能几乎相同，但形成产物M8和M9的相对能量极高。因此，从各通道各步骤活化能大小及各异构体相对能量高低等因素分析判断，可以认为，通道（5）是最有利的异构化反应路径。因此可以预测，气相中5-甲基胞嘧啶主要以氨-酮式异构体M1形式存在，同时也会有微量的氨-烯醇式异构体M5和M6以及痕量的氨-酮式M2同时存在。

以下仅以通道（5）为例来分析异构化过程几何构型的变化。结合图1和图2可以看出，当氨-酮式异构体M1经过渡态TSM1/M5使HT由N1转移到O2，形成中间体氨-烯醇式异构体M5时，C2=O2键的键长由1.240Å增大至1.360Å，C2-N3键由1.380Å减小至1.330Å，说明随着HT的转移，C2=O2逐渐向单键转变，而C2-N3逐渐向双键转变。同时，在HT转移过程中，嘧啶环形状发生较大变化，环内键角N1C2N3增大了11.4º，C2N3C4减小了4.5º，N3C4C5增大了-2.0º，环外键角O2C2N3减小了9.5º。第二步经过渡态TSM5/M6是氨-烯醇式异构体M5和M6的互变异构化过程，使O-H键绕C2-O2键旋转约90°形成产物M6时，除了键长C2-N3由原来的0.1340 nm缩小至1.330Å外，其余键长及键角等参数均未发生大的变化。因此，键旋转异构化所需的活化能较低，仅有34.49 kJ·mol-1。第三步经过渡态TSM6/M2，使HT由O2转移至N3形成氨-酮式，C2-O2、C2-N3等的键长以及键角等参数也发生类似于步骤1的变化。单双键转变及环骨架的显著改变必然需要较大的变形能量。所以5-甲基胞嘧啶分子内质子转移异构化的活化能较高，这与胞嘧啶分子内质子转移异构化的结果相似。另外，比较第一步质子迁移经历的过渡态TSM1/M5以及第三步质子迁移经历的过渡态TSM6/M2的结构和表1中的数据可发现，对结构相似的过渡态，其相对能量也很相近。

3 结论

本文通过B3LYP/6-31++G//B3LYP/6-31G方法对5-甲基胞嘧啶10种异构体稳定性以及各异构体间相互转化机理的详细计算研究，可得出如下结论：

1） 5-甲基胞嘧啶各互变异构体的相对热力学稳定性为：M1＞M3＞M4＞M5＞M6＞M2＞M7 ＞M8＞M9＞M10。其中氨-酮式结构的M1能量最低，稳定性最高，亚氨-烯醇式结构的M10相对能量最高，稳定性最低。

图 3 分子内质子迁移及键旋转异构化时的反应势能剖面图

2） 在5-甲基胞嘧啶的异构化过程中，质子迁移反应涉及化学键的断裂，其活化吉布斯自由能较大，反应较难进行。键旋转异构化过程仅需要单键旋转即可完成，其活化吉布斯自由能较小，反应较易进行。

［1]Leszcynski J. Tautomerism of uracil： the final chapter fourthorder electron correlation contributions to the relative energies of tautomers ［J］. ChemInform.， 1992， 23（24）： 1649-1653.

［2]Boughton J W， Peter P. The tautomers of uracil： a local correlation treatment ［J］. Int. J.Quant.Chem.， 1993， 47（1）：49-58.

［3]Brown R D， Godfrey P D， Mcnaughton D， Pierlot A P. Tautomers of cytosine by microwave spectroscopy ［J］. J. Am. Chem. Soc.， 1989， 111（6）： 2308-2310.

［4]Szczesniak M， Szczepaniak K， Kwiatkowski J S， Kubulat K， Person W B. Matrix isolation infrared studies of nucleic acid constituents. 5. Experimental matrix-isolation and theoretical ab initio SCF molecular orbital studies of the infrared spectra of cytosine monomers ［J］. J. Am. Chem. Soc.，2002， 110（25）： 8319-8330.

［5]Ehrlich M， Gamasosa M A， Huang L H， Midgett R M， Kuo K C， Mccune R A， Gehrke C. Amount and distribution of 5-methylcytosine in human DNA from different types of tissues of cells ［J］. Nucleic Acids Res. 1982， 10（8）： 2709-2721.

［6]Per Arne A， Marit O， Falnes P O， et al. Human and bacterial oxidative demethylases repair alkylation damage in both RNA and DNA ［J］. Nature， 2003， 421（6925）：859-863.

［7]Trewick S C， Henshaw T F， Hausinger R P， Tomas T， Barbara S. Oxidative demethylation by escherichiacolialkB directly reverts DNA base damage ［J］. Nature， 2002， 419（6903）： 174-178.

［8]Andrzej L， Adamowicz L， Bartlett R J. Relative stability of cytosine tautomers with the coupled cluster method and first-order correlation orbitals ［J］. J. Phys. Chem.， 1989，93（10）： 4001-4005.

［9]Shugar D， Szczepaniak K. Tautomerism of pyrimidines and purines in the gas phase and in low-temperature matrices and some biological implications ［J］. Int. J. Quant. Chem.，1981， 20（2）： 573-585.

［10]Santamaria R， Charro E， Zacarias A， Castro M. Vibrational spectra of nucleic acid bases and their Watson-Crick pair complexes ［J］. J. Comput. Chem.， 1999（20）： 511-530.

［11]张慧，薛英，徐开来，谢代前，鄢国森. 2，4-二硫基胸腺嘧啶的异构化和质子迁移的理论研究［J］.化学学报，2003，61（12）：1926-1929.

［12]周子彦，吴学，苏忠民，谢玉忠，潘秀梅，丁文兵. 3，6-二羟基哒嗪质子转移过程的理论研究［J］.化学学报，2004，62（22）：2244-2252.

［13]Ahn， D S， Lee S， Kim B. Solvent-mediated tautomerization of purine： single to quadruple proton transfer ［J］. Chem. Phys. Lett.， 2004， 390（4）： 384-388.

［14]Liang X， Zheng W， Wong N B， Li J， Tian A. Theoretical study on the mechanism of keto-enol isomerization for cyanuric acid and cyameluric acid ［J］. J. Mol. Struct.， 2004，672 （1/3）： 151-159.

［15]Liang X Q， Zheng W X， Wong N B， Shu Y J， Tian A M. Solvent-assisted catalysis mechanism on Keto enol tautomerism of cyameluric acid ［J］. J. Mol. Struct.， 2005，732（1）： 127-137.

［16]Gonzalez C， Schlegel H B. An improved algorithm for reaction path following ［J］. J. Chem. Phys.， 1989（90）： 2154-2161.

［17]M J Frisch， H B Schlegel， G E Scuseria， M A Robb， J R Cheeseman， J A Montgomery， T Vreven， K N Kudin， J C Burant， J M Millam， S S Iyengar， J Tomasi， V Barone， B Mennucci， M Cossi， G Scalmani， N Rega， G A Petersson，H Nakatsuji， M Hada， M Ehara， K Toyota， R Fukuda， J Hasegawa， M Ishida， T Nakajima， Y Honda， O Kitao， H Nakai， M Klene， X Li， J E Knox， H P Hratchian， J B Cross，C Adamo， J Jaramillo， R Gomperts， R E Stratmann， O Yazyev， A J Austin， R Cammi， C Pomelli， J W Ochterski，P Y Ayala， K Morokuma， G A Voth， P Salvador， J J Dannenberg， V G Zakrzewski， S Dapprich， A D Daniels，M C Strain， O Farkas， D K Malick， A D Rabuck， K Raghavachari， J B Foresman， J V Ortiz， Q Cui， A G Baboul，S Clifford， J Cioslowski， B B Stefanov， G Liu， A Liashenko，P Piskorz， I Komaromi， R L Martin， D J Fox， T Keith， M A Al-Laham， C Y Peng， A Nanayakkara， M Challacombe， P M W Gill， B Johnson， W Chen， M W Wong， C Gonzalez，and J A Pople. In Gaussian 03， revision C.02； Gaussian，Inc.： Wallingford CT， 2004.

［18]Mezey P G， Ladik J J. A non-empirical molecular orbital study on the relative stabilities of denine and guanine tautomers ［J］. Theor. Chim. Acta.，1979， 52（2）： 129-145.

Theoretical Study on Thermodynamic Stability of Tautomers and Proton Transfer Isomerization of 5-Methylcytosine

JIN Ling-xia1， YANG Jia-hong1， LI Chen1， MIN Suo-tian1， WEI Ya-wen2
（1.Shaanxi Province Key Laboratory of Catalytic Fundamentals & Applications， School of Chemical & Environment Science， Shaanxi University of Technology， Hanzhong 723001， China； 2.Institute of publication Science， Chang’an University， Xi’an 710064， China）

The stability and tautomerism mechanisms of 5-methylcytosine had been investigated by the B3LYP/6-31++G//B3LYP/6-31G level of theory. 10 tautomers and 12 transition states were located and a variety of possible reaction pathways were probed. The reaction enthalpies， activation energies， activation free energies and the rate constants of tautomerism were also obtained. The results showed that the order of the thermodynamic stability of tautomers was： M1＞M3＞M4＞M5＞M6＞M2＞M7＞M8＞M9＞M10. The aminoketo form was the predominant isomer. 6 reaction pathways from amino-keto to other isomers were found by intramolecular proton transfer and tautomerisms process. The main pathway （5） associated with the activation energy was 163.8 kJ/mol， which was of no advantage to the reaction.

5-methylcytosine； density functional theory method； tautomerism； transition state

O 642

A

1671-9905（2016）06-0001-05

中央高校基金资助项目（310850160322）；陕西省教育厅专项科研基金项目（16JK1153）；陕西理工学院科研基金资助项目资助（SLGQD14-10， SLGKYQD2-13）

靳玲侠（1981-），女，讲师，博士，主要从事小分子反应机理的理论研究。E-mail： jinlx@snut.edu.cn

2016-04-06