更昔洛韦与DNA分子相互作用的紫外光谱研究

贺泽峰，王晓霞，郭贵宝，王正德，闫 慧

更昔洛韦与DNA分子相互作用的紫外光谱研究

贺泽峰，王晓霞，郭贵宝，王正德，闫 慧

（内蒙古科技大学化学与化工学院，内蒙古 包头 014010）

在不同浓度、时间、pH等条件下，利用紫外分光光度法研究更昔洛韦（GCV）与鲑鱼精DNA的相互作用。结果表明，鲑鱼精DNA紫外吸收值随溶液中GCV浓度的增加而增加；在pH=4.0～9.0条件下，GCV与DNA大分子以槽沟式结合。根据实验结果，利用双倒数分析法计算出GCV与鲑鱼精 DNA相互作用的结合常数为KDNA-GCV=6.51×102mL·mg-1。

鲑鱼精DNA；紫外光谱；更昔洛韦

脱氧核糖核酸（DNA，Deoxyribonucleic acid），又称去氧核糖核酸，是生物体的重要组成物质，也是遗传信息的载体和基因表达的物质基础，它在生物体的生长、发育和繁殖等生命活动过程中具有十分重要的作用［1］。DNA与药物分子相互作用的研究对探讨生命过程的机制、DNA生物传感器的研制、DNA药物的设计与合成以及药物抗病机制的研究都具有重要的意义［2］。在医学中，也经常将DNA与小分子物质相互作用，用以研究和阐明抗肿瘤、抗病毒以及致癌致病机制，同时也为新型药物设计合成以及药物体外筛选提供理论支持［3］。因此，研究DNA与药物小分子的相互影响，对于理解其物理和生物机制都具有非常重要的科学意义。

更昔洛韦（丙氧鸟苷，GCV，DHPG），别名赛美维、丽科伟，化学名9-（1，3-二羟基-2-丙氧甲基）鸟嘌呤，是一种新的核苷酸嘌呤类抗病毒药物，临床上用于预防和治疗巨细胞病毒感染。但是该药物毒性大，仅限于治疗严重免疫功能并发的巨细胞病毒感染，如艾滋病患者、接受化疗的肿瘤患者、使用免疫抑制剂的器官移植病人等［4］。我们在不同浓度、时间、pH等条件下，利用紫外分光光度法研究更昔洛韦（GCV）与鲑鱼精DNA的相互作用，通过系列实验，旨在对GCV的理化性质和与DNA的作用原理有一个全面的认识，进而对GCV在临床上治疗免疫功能并发的巨细胞病毒感染提供必要的理论支持。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

试剂：Tris（分析纯），浓盐酸（分析纯），NaCl（分析纯），鲑鱼精DNA，更昔洛韦，GCV。

用PHS-25C pH检测计配制pH为2.01、3.00、4.06、5.02、6.01、7.01、8.01、9.05的Tris-HCl溶液。

将鲑鱼精DNA用浓度为0.05mol·L-1的NaCl溶液配成DNA溶液，置于4℃下保存，用260nm处的吸光度与280nm处的吸光度比值检验DNA纯度，A260/A280＞1.83则符合要求。紫外分光光度计在260nm处检测的DNA浓度为1111μg·mL-1。

用电子天平称取一定量的GCV，用pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液配制成浓度为1.0×10-4mol·L-1的工作液。

紫外分光光度计检测发现，浓度为0.21mg·mL-1的鲑鱼精DNA，1.0×10-4mol·L-1的GCV的紫外吸收值在0.434左右，误差最小。

1.2 实验方法

1.2.1 GCV浓度递增与固定浓度DNA的反应

准备9支干净的10mL试管，每个试管均加入浓度为0.21mg·mL-1的DNA工作液1mL，从第1个试管到第9个试管依次加入0、0.5、1.0、1.5……4mL的浓度为1.0×10-4mol·L-1的GCV工作液，然后定容到10mL。静置反应一段时间之后，以二次蒸馏水为参比，用紫外分光光度计检测GCV和鲑鱼精DNA的混合溶液。

1.2.2 DNA工作液浓度递增与固定浓度GCV的反应

准备9支干净的10mL试管，每个试管均加入1mL浓度为1.0×10-4mol·L-1的GCV溶液，从第1个试管到第9个试管依次加入0、1、2、3……8mL的浓度为0.21mg·m L-1的DNA工作液，然后定容到10mL。静置反应一段时间之后，以二次蒸馏水为参比，用紫外分光光度计检测GCV和鲑鱼精DNA的混合溶液。

1.2.3 不同反应时间对反应体系的影响

准备1支干净的10mL试管，试管内加入1mL浓度为0.21mg·mL-1的DNA工作液和1mL浓度为1.0×10-4mol·L-1的GCV溶液，然后定容到10mL。以二次蒸馏水为参比，将混合溶液用紫外分光光度计检测，完后将被检测液再倒入原10mL试管，反应时间为0、4、8、12、16、20、24、28、32、42min，即每隔4min测量1次，待到反应32min检测完之后，隔10min测量1次即可。

1.2.4 不同pH值对反应体系的影响

准备9支干净的10mL试管，每个试管均加入1mL浓度为1.0×10-4mol·L-1的GCV溶液和浓度为0.21mg·mL-1的DNA工作液1mL，第1个试管不加Tris-HCl缓冲溶液，从第2个试管开始依次加入2mL的pH为2.01～9.05的Tris-HCl缓冲溶液，然后定容到10mL。以二次蒸馏水为参比，用紫外分光光度计检测GCV和鲑鱼精DNA的混合溶液在不同pH值条件下的紫外光谱。

2 实验结果与分析

2.1 GCV与DNA工作液反应的紫外光谱

图1是GCV与浓度为0.021mg·mL-1的DNA混合液的紫外吸收光谱。由图1可见，随着GCV浓度的增加，DNA紫外吸收光谱的最大吸收峰从0.0038增加到0.3856，增加了0.3818；最大吸收波长从263nm左移到252nm处，蓝移了11nm。

图1 GCV与0.021mg·mL-1的DNA混合液的紫外吸收光谱

图2是DNA与浓度为1.0×10-5mol·L-1的GCV混合液的紫外吸收光谱。由图2可见，随着DNA工作液浓度的增加，GCV药物紫外吸收光谱的最大吸收峰从0.1031增加到0.1288，增加了0.0257；最大吸收波长稳定在252nm（253nm）处。

图2 DNA与1.0×10-5mol·L-1的GCV混合液的紫外吸收光谱

紫外吸收光谱图（图3）分别为浓度为0.21mg·mL-1的 DNA工作 液（曲 线 a）、1.0× 10-4mol·L-1的GCV（曲线b）以及两者混合液的吸收曲线（曲线c）。由图3可见，DNA在波长263nm处有一较大的吸收峰（曲线a），而GCV（曲线b）的最大吸收峰在波长252nm，两者混合后的吸光度相对于DNA的吸收，吸光度明显增大且伴随蓝移（曲线c，252nm）。实验证明，根据紫外吸收值具有叠加效应［5-7］，可以得出GCV与DNA发生了相互作用并形成了复合物，进而改变了DNA原来的紫外吸收性质，最终表现为特征峰波长蓝移，强度增加，但又不完全等于单纯的a、b曲线叠加。

根据long［8-10］的理论，小分子与DNA发生插入式结合时，将会发生红移与减色。而本实验发现GCV与DNA结合时呈现的却是蓝移增色现象。这表明该药物没有插入到DNA碱基对之间的平面中，可能通过氢键作用结合在DNA螺旋结构的大小沟上，也就是说结合在DNA上的GCV药物是暴露在溶液中，所以表现为在DNA溶液中随着GCV浓度的增加，结合在DNA上药物物质的量也随之增加，这就必然导致DAN吸收强度的增加（图3所示）。而GCV在中性条件下的特征峰出现在252nm处，所以随着GCV物质的量的增加必然引起DNA紫外吸收发生相应的蓝移。增色效应和减色效应是与DNA双螺旋结构和空间构型密切相关的特有光谱性质。因此，综上所述，可得出GCV与DNA的结合方式为槽沟式，并非插入式。

图3 DNA、GCV及其两者混合物的紫外-可见吸收光谱

2.2 更昔洛韦的浓度对DNA的影响

图4是DNA紫外吸收峰值随GCV梯度浓度的变化关系图。由图4可见，DNA的最大吸收值随GCV药物与DNA浓度的比值呈线性关系。根据文献［11］的研究观点，说明GCV与DNA结合是一配基一受点的结合方式。根据双倒数公式有［12-13］：

图4 DNA紫外吸收峰值随GCV梯度浓度的变化关系

式中：A0、A分别表示加入DNA前后的药物紫外吸收值，K表示结合常数。

代入实验结果（图5），经计算，DNA与浓度为1.0×10-5mol·L-1的GCV相互作用的结合常数为KDNA-GCV=6.51×102mL·mg-1，这说明GCV在DNA上存在很多结合位点。

图5 DNA与GCV反应的双倒数曲线

2.3 不同反应时间条件下更昔洛韦与DNA的紫外吸收情况

表1是GCV（1.0×10-5mol·L-1）与DNA（2.1× 10-2mg·mL-1）反应后混合溶液紫外吸收值随时间变化的情况。由表1可见，随着时间的延长，GCV 与DNA在不同时间上的紫外吸收光谱曲线峰值从0.1061增加到0.1847，总体上升了0.0786。即随着反应时间的增加，GCV与DNA相互作用的紫外吸收峰值呈现上升趋势。同时，根据实验结果还可以得出，当反应达到一定时间（30min左右），混合溶液的紫外吸收值呈现出稳定状态。如此便说明GCV 与DNA在结合时伴随有扩散过程［14-15］。

GCV加入到DNA溶液中时，GCV与DNA并没有马上发生反应，而是呈现出一种扩散趋势，此时的DNA并没有受到GCV药物分子的影响，对应的DNA特征峰值（263nm）没有变化；但当GCV扩散至DNA分子附近时，GCV药物与DNA便发生结合，在这个反应过程中该反应体系的紫外吸收峰值不稳定。可能的原因是GCV上的基团与DNA不断发生反应，二者相互作用，使得DNA分子上的碱基共轭基团受到了GCV的影响，因此表现为紫外吸收光谱中DNA特征峰强度逐渐增加。同时，随着反应时间的增加，GCV与DNA反应的速率逐渐下降直至达到一个动态平衡。这也说明GCV与DNA的结合并没有特异性，而是随机的结合。

表1 GCV与DNA混合溶液在不同反应时间条件下的紫外吸收值

2.4 不同pH条件下更昔洛韦与DNA的相互作用

图6和图7是浓度为0.021mg·mL-1的DNA和浓度为1.0×10-5mol·L-1的GCV在不同pH下的紫外吸收光谱曲线。由图6可见，当pH在3.00 和8.00左右时，有2个明显的波峰，其中以pH为8.00左右时GCV与DNA混合溶液的紫外吸收峰为最大。其变化的总体趋势为：2.00～3.00上升，3.00～5.00下降，5.00～8.00上升，8.00～9.00下降。由图7可见，GCV与DNA相互作用后紫外特征峰波长随pH值增加，总体呈现红移，其中以pH值为9.05时，特征峰波长红移现象最为明显，红移了4nm（从252nm移至256nm），当pH在2.01～7.01之间时，GCV与DNA的相互作用较为稳定［16］。

由核酸化学可知，当pH低于4.0或者大于11.0时，酸碱可引起DNA碱基对之间的氢键变性，致使DNA双螺旋结构发生变化。结合理论，对图6、7进行分析便可以得出，当pH值在8.00左右时，GCV 与DNA的混合液紫外吸收峰值最大，特征峰波长红移。

图6 GCV与DNA相互作用后紫外吸收峰强度随pH值变化关系

图7 GCV与DNA相互作用后紫外特征峰波长随pH值变化关系

3 结论

本文利用紫外光谱法研究了GCV与DNA在不同条件下的相互作用。实验过程中，通过探究一定的药物浓度、反应时间以及pH值条件下展开的系列实验，得到的是GCV并没有通过嵌插方式结合到DNA的碱基上而发生减色红移，而是有明显的增色蓝移，这表明GCV是以槽沟式的方式与DNA相互结合。同时，利用双倒数法求得GCV与鲑鱼精DNA相互作用的结合常数为6.51×102mL·mg-1，即GCV与DNA已经发生了相互作用。通过实验结果还进一步得出，生物大分子（DNA）与药物小分子（GCV）的相互作用受到多方面因素的影响，包括药物（GCV）的浓度、反应时间和pH值的不同，其中以药物浓度的影响较为显著。这就意味着，在生物分子领域，物质之间的相互作用力还是以静电力、范德华力等电磁相互作用为主。

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Study on Interaction of Ganciclovir with DNA by Ultraviolet Spectroscopy

HE Ze-feng， WANG Xiao-xia， GUO Gui-bao， WANG Zheng-de， YAN Hui
（School of Chemistry and Chemical Engineering， Inner Mongolia University of Science and Technology， Baotou 014010， China）

At different concentrations， different times and different pH， the interaction between GCV and salmon sperm DNA was studied by UV-visible spectrophotometry. The results showed that UV adsorption values of salmon sperm DNA increased with the increase of GCV concentration. GCV binded DNA’s groove when pH=4.0～9.0. The combination constant between GCV and salmon sperm DNA was calculated by double reciprocal analysis and the combination constant was KDNA-GCV=6.51×102mL/mg.

salmon sperm DNA； UV spectroscopy； ganciclovir

Q 523

A

1671-9905（2016）06-0009-04

内蒙古自然科学基金项目（2013MS0209）；内蒙古高等学校科学研究项目（NJZZ14160）；内蒙古科技大学大学生创新基金（2014068）

王晓霞（1984-），女，内蒙古包头市人，讲师，硕士，主要从事荧光光谱分析。电话：（0472）5951561；传真：（0472）5951561；E-mail：wxx572369@163.com

2016-04-19