β1受体阻滞剂对力竭运动大鼠心肌能量代谢变化的影响及其机制

纪丽丽，李晓燕，，孟可，张国明，张红明，陈英剑

β1受体阻滞剂对力竭运动大鼠心肌能量代谢变化的影响及其机制

纪丽丽1，李晓燕1，2，孟可1，张国明2，张红明2，陈英剑3

目的 探讨β1受体阻滞剂对力竭运动大鼠心肌能量代谢变化的影响及其对应激心肌的保护机制。方法 雄性Wistar大鼠36只，随机分为对照组、一次力竭组、一次力竭+倍他乐克治疗组，每组各12只。游泳力竭后测定心肌ATP、血浆肾上腺素（epinephrine，E）、去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）、游离脂肪酸（free fatty acid，FFA）浓度，荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）及Western blot法分析心肌线粒体解偶联蛋白2（uncoupling protein 2，UCP2）表达。结果 与对照组相比，一次力竭组、一次力竭+倍他乐克治疗组血浆FFA、E、NE浓度均增高，心肌ATP含量均降低（P＜0.05）。RT-PCR结果表明一次力竭组、一次力竭+倍他乐克治疗组UCP2mRNA表达量较对照组分别增加64%、43%（P均＜0.05）。Western blot结果表明一次力竭组、一次力竭+倍他乐克治疗组UCP2表达量较对照组分别增加78%、42%（P均＜0.05）。相关分析显示血浆FFA浓度与血浆E、NE水平呈显著正相关（r=0.93，r=0.88，P＜0.01），心肌组织UCP2表达量与血浆FFA浓度呈显著正相关（r=0.98，P＜0.01）。结论 应用β1受体阻滞剂后可降低运动应激对心肌能量代谢的不利影响，减轻心脏负荷。

解偶联蛋白2；心源性猝死；β1受体阻滞剂；游离脂肪酸；大鼠

运动猝死因发生突然、难于预防，一直是医学领域的一项难题，WHO和国际心脏病学会定义运动性猝死为有或无症状的运动员或体育锻炼者在运动中或运动后24 h内意外死亡［1］，其发生机制目前尚不完全明确。解偶联蛋白2 （Uncoupling protein 2，UCP2）是一种线粒体质子转运蛋白，可调节H+的跨膜转运，消除H+在线粒体内膜两侧的电化学梯度，解除呼吸链氧化磷酸化和ATP合成的耦联，使H+氧化过程中释出的能量转化为热量释放而不生成ATP，在基础代谢的调节中起重要作用。β1受体阻滞剂，如美托洛尔可减弱与生理和心理负荷有关的儿茶酚胺的作用，拮抗应激状态下交感神经兴奋对心脏的影响。本实验通过观察力竭运动后大鼠心肌UCP2的表达及其与心肌能量代谢变化的关系，探讨运动导致心肌损伤的可能机制，及应用β1受体阻滞剂美托洛尔后能否通过影响UCP2的表达，改善运动时心肌能量代谢障碍，保护应激状态下的心肌细胞。

1 材料与方法

1.1主要试剂 酒石酸美托洛尔（50 mg，英国阿斯利康）；亚细胞结构线粒体提取试剂盒（武汉博士德生物）；BCA蛋白质定量试剂盒（武汉博士德生物）；两步法逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒（美国BIO-RAD）；UCP2抗体（美国 Millipore）；抗β-Actin兔多克隆抗体（北京康为世纪生物）；山羊抗兔IgG（H+L），辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）（北京康为世纪生物）。

1.2实验动物及分组 雄性Wistar大鼠36只（由山东大学实验动物中心提供），3月龄，体重200～250 g，所有大鼠均先适应性喂养3 d，并在3 d内适应性游泳3次， 15 min/次。泳池体积100× 70×80 cm，水深50 cm，水温控制在28℃～32℃。第4 d按简单完全随机分组法随机分为对照组（12只，不运动，0.5 ml/d/只生理盐水灌胃，维持7 d），一次力竭组（12只，不运动，0.5 ml/d/只生理盐水灌胃，维持7 d，第8 d进行一次力竭运动），一次力竭+倍他乐克治疗组（12只，酒石酸美托洛尔50 mg溶于10 mL生理盐水，根据体重为50 kg的成人使用剂量及大鼠体重换算后，以2.5 mg/d/只灌胃，维持7 d，第8 d进行一次力竭运动）。力竭标准：大鼠沉入水底超过10 s或游泳动作明显不协调，捞出后无逃避反应且无法完成翻正反射［2］。

1.3大鼠血浆游离脂肪酸（free fatty acids，FFA）浓度测定 第8 d游泳大鼠达力竭状态后立即处死取血离心得血浆，于济南军区总医院生化室全自动生化检测仪检测大鼠血浆FFA浓度。

1.4大鼠血浆肾上腺素（epinephrine，E）、去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）浓度，心肌组织ATP含量测定 采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定上述指标，其中ATP测定先取大鼠心肌组织加入一定量磷酸盐缓冲液（Phosphate buffered saline，PBS）（PH 7.4）匀浆后3000 r/ min离心20 min后取上清。按说明书进行ELISA反应，底物在辣根过氧化物酶催化下转化成蓝色，并在酸的作用下最终转化成黄色，且颜色的深浅与样品中待测物浓度呈正相关，在450 nm波长下测定OD值，根据标准品和样本的OD值，计算得样本中E、NE浓度和ATP含量。

1.5实时荧光定量RT-PCR测定大鼠心肌线粒体中UCP2mRNA表达 Trizol法提取心肌总RNA并测定其浓度及纯度。根据GenBank上发表的UCP2序列设计荧光定量PCR引物：上游5’-CAAGA CCATTGCACGAGAGG-3’，下游5’-CCCGAA GGCAGAAGTGAAG-3’，退火温度59℃，共40个循环。内参β-actin荧光定量PCR引物序列：上游5’TGGCACCCAGCACAATGAA-3’，下游5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’，退火温度为59℃，共40个循环。取同一样本总RNA 1μL进行RT-PCR反应。

1.6Western blot测定大鼠心肌线粒体UCP2蛋白表达 取大鼠心肌组织约200 mg低温差速离心法提取线粒体，二喹啉甲酸（Bicinchoninic acid，BCA）法测定线粒体总蛋白含量。进行10%SDSPAGE电泳，上样量体积含50μg蛋白，电泳后转膜、封闭各90 min，然后加入1:1000的一抗稀释液4℃封闭过夜。TBST洗3遍，然后加入1:10000的辣根过氧化物酶标记的二抗稀释液37℃孵育90 min后进行化学发光显影。凝胶分析用Quantity One计算条带光密度值。

1.7统计学分析 用SPSS13.0统计学软件进行统计分析。计量资料采用（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1大鼠心肌组织ATP含量和血浆FFA、E、NE浓度比较 与对照组相比，一次力竭组、一次力竭+倍他乐克治疗组心肌ATP含量均降低，血浆FFA含量、E浓度、NE浓度均增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。一次力竭+倍他乐克治疗组心肌ATP含量高于一次力竭组，血浆FFA含量、E浓度、NE浓度均低于一次力竭组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

2.2大鼠心肌组织UCP2mRNA的表达测定 与对照组相比，一次力竭组、一次力竭+倍他乐克治疗组UCP2mRNA表达量均上调，分别增加64%、43%，差异均有统计学意义（P＜0.05）。一次力竭+倍他乐克治疗组UCP2mRNA表达较一次力竭组降低31%，差异有统计学意义（P＜0.05）。（图1）。

2.3大鼠心肌组织UCP2蛋白的表达测定 一次力竭组、一次力竭+倍他乐克治疗组UCP2蛋白表达量较对照组表达量分别增加约78%、42%，差异均有统计学意义（P＜0.05）。一次力竭+倍他乐克治疗组UCP2表达较一次力竭组降低26%，差异有统计学意义（P＜0.05）（图2、图3）。

2.4Pearson相关性分析 心肌组织ATP含量与UCP2表达量呈显著负相关（r=-0.78，P ＜0.01）（图4A）。血浆FFA浓度与血浆E、NE水平呈显著正相关（r=0.92和r=0.86，P均＜0.01）（图4B、图4C）。心肌组织UCP2表达量与血浆FFA浓度呈显著正相关（r=0.814，P ＜0.01）（图4D）。

表1　各组心肌ATP含量及血浆FFA、E、NE浓度比较（±s）

表1　各组心肌ATP含量及血浆FFA、E、NE浓度比较（±s）

注：ATP：三磷酸腺苷；FFA：游离脂肪酸；E：肾上腺素；NE：去甲肾上腺素；与对照组相比，aP＜0.05；与一次力竭组相比，bP＜0.05

分组　ATP含量（ng/mL）　FFA含量（mmol/L）　E浓度（ng/L）　NE浓度（ng/L）对照组　14.54±0.11　0.13±0.06　58.56±1.78　73.46±0.66一次力竭组　9.45±0.91a　0.43±0.10a　119.07±4.72a　123.30±3.09a一次力竭+倍他乐克治疗组　11.01±0.46ab　0.29±0.03ab　105.74±2.84ab　118.83±2.53ab

3 讨论

机体在剧烈运动等应激刺激下，交感-肾上腺髓质系统活性增强，血中儿茶酚胺类物质含量迅速上升，心肌代谢水平增强，耗氧量增加，当最大摄氧量保持不变时，无论运动强度的大小，血浆去甲肾上腺素浓度都会不断增加，直至力竭状态［3，4］。本实验也证实，当大鼠运动达力竭状态后血浆中肾上腺素和去甲肾上腺素浓度较对照组明显升高，相关分析显示，血浆FFA浓度与血浆E、NE水平呈显著正相关，提示当血浆儿茶酚胺类浓度增加时可加速脂肪分解，儿茶酚胺类与其受体（主要是β1、β3受体）结合后，通过G蛋白-腺苷酸环化酶（adenylyl cyclase，AC）途径使环-磷酸腺苷（cyclic adenosine monophate，cAMP）水平增高并激活蛋白激酶A（PKA）加速脂肪水解，使胞浆中FFA浓度增加。

心肌收缩时肌丝的滑动和Ca2+的转运都需要ATP不断水解提供能量，故当能量代谢发生障碍时，心肌舒缩功能亦受影响。李楠等［5］研究发现心力衰竭（心衰）时大鼠心肌UCP2表达增加，且随UCP2的增加线粒体ATP合成减少，表明心衰时的能量代谢障碍与UCP2表达增加有关。本实验发现，经过游泳运动达力竭状态的大鼠心肌组织UCP2mRNA和UCP2蛋白含量均增加，ATP含量明显下降，ATP的下降程度与UCP2的增高程度显著相关。虽然UCP2表达增加使氧化磷酸化过程脱偶联，呼吸链电子回漏减少，活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成减少，对组织细胞的应激损伤减少［6］，但UCP2的不适当增加会进一步加重线粒体能量代谢紊乱，影响心肌正常舒缩功能，反而加重心肌损伤。相关分析提示UCP2表达的增加与血浆FFA增高呈显著正相关，血浆FFA水平增高会诱导心肌组织UCP2表达上调，Murray等［7］经实验证实，FFA是通过过氧化物酶体增殖物活化受体（peroxisome proliferatoractivited receptors，PPARs）诱导UCP2基因表达的，其作用途径可能是通过ROS介导的，PPARα能增加线粒体β-氧化，从而ROS的产生增多，导致UCP2mRNA上调。对UCP2的启动子研究表明，UCP2启动子区域包含ROS敏感性作用因子（AP-1和C/EBP）［8］。

本实验发现，应用β1受体阻滞剂美托洛尔后进行力竭运动的大鼠心肌组织UCP2mRNA和UCP2蛋白表达均较未用药组下调，血浆FFA浓度、NE、E浓度均较未用药组降低，而心肌ATP含量较未用药组升高，差异均有统计学意义，提示应用β1受体阻滞剂后可通过减弱交感神经紧张性，降低儿茶酚胺类浓度，减少血浆FFA生成，降低心肌UCP2的表达，提高ATP储量，降低氧化应激对心肌的损伤。美托洛尔是一种选择性β1受体阻滞剂，能增加中枢神经和心脏传出迷走神经的张力，通过减慢心率、降低心脏负荷及心肌收缩力，减少心肌细胞耗氧量［9］。Leenhardt等［10］研究证实，β1受体阻滞剂能有效阻断肾上腺素能受体，使交感神经兴奋性减弱，儿茶酚胺类分泌减少，提高应激、紧张或运动所诱发的室颤阈值，降低心率、减少室颤、稳定心电活动，减少由交感活性增强引起的运动性猝死的发生。本实验结果与Leenhardt研究结果相符，故推断应用β1受体阻滞剂后能改善心肌能量代谢障碍，可能会降低运动中恶性心脏性事件的风险，对心源性猝死的预防有一定积极作用。

图1　各组线粒体UCP2mRNA的表达量比较

图2　各组心肌线粒体UCP2蛋白表达检测

图3　各组心肌线粒体UCP2蛋白表达的比较

图4　A 心肌组织UCP2蛋白表达量与ATP含量的散点图

图4　B 血浆E浓度与FFA含量的散点图

图4　C 血浆NE浓度与FFA含量的散点图

图4　D 血浆FFA与心肌组织UCP2蛋白表达量的散点图

体力活动可降低动脉粥样硬化性心血管病的风险，减少心血管疾病死亡率［11］，但剧烈的体力活动能增加心脏性事件的风险，包括心源性猝死（SCD）［12］和急性心肌梗死（AMI）［13］。运动性猝死常见的心源性原因包括：肥厚型心肌病（HCM）、致心律失常性右室心肌病（ARVC）、长QT间期综合征（LQTS）、先天性冠状动脉畸形、马凡综合征、心脏震荡［14］。据统计，在＜35岁的年轻运动员中HCM是发生运动性猝死的最常见原因，约占运动员猝死的36%［15］，其特征性改变是左室壁不均一肥厚和心肌节段间厚度移行差异显著。运动训练往往是长时间的体力和心理应激，运动时引起血浆儿茶酚胺类浓度增加的部分原因是运动焦虑造成交感肾上腺系统活动增强引起的，且和运动者主体的心理特征密切相关［16］。β1受体阻滞剂能够弛缓肥厚的心肌，降低心率及降低心肌细胞耗氧量，能减弱心理负荷有关的儿茶酚胺的作用，且在应激状态下不会妨碍正常的生理性血管扩张，推测在运动前给予β1受体阻滞剂可能会减少SCD的发生。

综上所述，结合本研究及以往研究发现，机体在急性超负荷运动后血浆E、NE浓度持续增加，加速脂肪分解，使血浆FFA升高，通过ROS介导使心肌UCP2表达上调，ATP合成减少，能量代谢障碍。在应用β1受体阻滞剂后可降低上述运动应激对心肌能量代谢的不利影响，减轻心脏负荷，推断其可能会减少运动训练中SCD的发生。

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本文编辑：阮燕萍

Influence of β1 receptor blocker on changes of myocardial energy metabolism and mechanism in ratsafter exhaustive exercise

JI Li-li*， LI Xiao-yan， MENG Ke， ZHANG Guo-ming， ZHANG Hong-ming， CHEN Ying-jian.*Liaoning Medical University Postgraduate Training Base of General Hospital of Chinese PLA Jinan Military Area Command， Jinan 250031， China.

LI Xiao-yan， E-mail: lixiaoyan902006@126.com

Objective To discuss the influence of β1receptor blocker on changes of myocardial energy metabolism and protective mechanism to stress myocardium in rats after exhaustive exercise. Methods Male Wistarrats （n=36） were randomly divided into control group， once exhaustion group and once exhaustion+metoprolol group （treatment group， each n=12）. The concentrations of myocardial ATP， plasma epinephrine （E）， norepinephrine （NE）and free fatty acid （FFA） were detected after exhaustive swimming. The expression of myocardial mitochondrial uncoupling protein 2 （UCP2） was analyzed by using RT-PCR and Western blot. Results Compared with control group， the concentrations of plasma FFA， E and NE increased and myocardial ATP decreased in once exhaustion group and treatment group （P＜0.05）. The results of RT-PCR showed that the expression of UCP2 mRNA increased by 64% in once exhaustion group and by 43% in treatment group compared with control group （all P＜0.05）. The results of Western blot showed that UCP2 expression increased by 78% in once exhaustion group and by 42% in treatment group compared with control group （all P＜0.05）. Correlation analysis showed that concentration of plasma FFA was positively correlated to levels of plasma E and NE （r=0.93， r=0.88， P＜0.01）， and UCP2 expression was greatly positively correlated to concentration of plasma FFA （r=0.98， P＜0.01）. Conclusion The application of β1receptor blocker can reduce adverse impact of exercise stress on myocardial energy metabolism， and relieve cardiac overload.

Uncoupling protein 2； Sudden cardiac death； β1receptor blocker； Free fatty acid； Rats

李晓燕，E-mail:lixiaoyan902006@126.com

R541

A

1674-4055（2016）01-0033-05

2014全军后勤科研计划项目（AWS13C008）
1250031 济南，辽宁医学院研究生院济南军区总医院研究生培养基地；2250031 济南，济南军区总医院心内科；3250031

济南，南军区总医院实验诊断科

10.3969/j.issn.1674-4055.2016.01.08