基于溶剂剥离石墨烯增敏效应的土霉素电化学检测新方法

赵 勇*

(武汉大学生命科学学院，湖北武汉 430072)

近年来，抗生素的滥用引起了广泛关注。土霉素(Oxytetracycline)是一种广泛使用的抗生素，开展其简便快速的检测新方法研究具有重要意义。目前土霉素的检测主要采用高效液相色谱法(HPLC)[1,2]和酶联免疫分析法[3]等。电化学检测具备快速、简便、低成本等优点，也成功用于土霉素的测定。如碳纳米管修饰玻碳电极[4]、印刷金电极[5]、多壁碳纳米管-离子液体-纳米金复合膜修饰玻碳电极[6]、壳聚糖-多壁碳纳米管-纳米金修饰玻碳电极[7]以及纳米铂-聚氨基酚-多壁碳纳米管修饰玻碳电极[8]等都被用于土霉素的电化学检测。

石墨烯结构奇特、性能优异，已在电化学检测领域获得了广泛关注，但其制备主要采用化学氧化法，需要消耗大量的强氧化剂，且操作繁琐。随着石墨烯制备技术的深入研究，溶剂剥离被认为是一种简便、高效的石墨烯制备方法[9]。研究证实溶剂剥离石墨烯的电化学活性优于传统化学法制备的氧化型石墨烯(GO)以及还原型石墨烯(RGO)[10,11]。本文以N-甲基吡咯烷酮(NMP)为剥离溶剂，通过超声石墨粉的方法一步制备出石墨烯纳米片(GS)，然后将GS固体分散在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，挥发溶剂后制备出GS修饰玻碳电极(GS/GCE)。与未修饰GCE相比，GS/GCE显著提高了土霉素的电化学氧化信号，表现出强的增敏效应。基于此，建立了一种高灵敏的土霉素电化学检测新方法，并成功用于实际样品分析。

1 实验部分

1.2 主要仪器与试剂

电化学测定在CHI 830D电化学工作站上进行(上海辰华仪器有限公司)，实验采用三电极系统：玻碳电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极。场发射扫描电子显微镜图(SEM)用Nova NanoSEM450 microscope(荷兰，FEI公司)测定得到。

光谱纯石墨粉、NMP、DMF，均购自国药集团化学试剂有限公司。土霉素(Sigma公司)溶于超纯水配制成0.01 mol/L的储备液，并在4 ℃储存。实验所用试剂均为分析纯，所用试剂均未经纯化而直接使用。

1.2 剥离石墨烯修饰玻碳电极的制备

准确称取1.50 g石墨粉，加入到300.0 mL NMP中，超声剥离12 h(功率100 W)，6 000 r/min离心5 min后，过滤、洗涤、干燥得到GS固体。然后，准确称取10.0 mg的GS固体，加入到5.00 mL DMF中，超声30 min，得到均匀的GS-DMF分散液。修饰前，3 mm玻碳电极用0.05 μm Al2O3抛光，清洗干燥后，用微量进样器移取4.0 μL的GS-DMF分散液滴涂到玻碳电极表面，红外灯下挥发掉DMF，即制备出修饰电极。

1.3 测定步骤

以0.1 mol/L、pH = 7.0的磷酸盐缓冲溶液(PBS)作为测定土霉素的介质，富集3 min后，记录0.1～0.9 V的差分脉冲伏安曲线，测量0.58 V的氧化峰电流值作为土霉素的响应信号。脉冲振幅为50 mV，脉冲宽度为40 ms，扫描速度为40 mV/s。

2 结果与讨论

2.1 NMP剥离石墨烯的性能表征

图1为NMP剥离石墨烯的透射电镜(TEM)照片，剥离后观察到大量的纳米级薄片，表明石墨粉已被成功剥离成石墨烯纳米片。

图2为GCE和GS/GCE的扫描电镜(SEM)照片。未修饰玻碳电极表面十分平滑(A)；而修饰上GS后，观察到大量的纳米片，表面粗糙度显著增加(B)。显而易见，GS的修饰将提供更多的作用位点，显著提高表面富集效率。

图1 NMP剥离石墨烯的透射电镜(TEM)图Fig.1 TEM image of NMP-exfoliated graphene

图2 GCE(A)和GS/GCE(B)表面的扫描电镜(SEM)图Fig.2 SEM images of GCE(A) and GS/GCE(B)

2.2 GS/GCE的信号增强效应

图3 5.0×10-7 mol/L土霉素在GCE(b)和GS/GCE(d)上的DPV曲线；GCE(a)和CS/GCE(c)在pH为7.0的 PBS中的DPV曲线Fig.3 DPV curves of 5.0×10-7 mol/L oxytetracycline on GCE(b) and GS/GCE(d);DPV curves of GCE(a) and CS/GCE in pH=7 phosphate buffer solution accumulation time:3 min.

用微分脉冲伏安法(DPV)研究了土霉素在不同电极上的电化学氧化行为，结果如图3所示。在GCE表面，土霉素的氧化活性很低，几乎没有氧化峰信号出现(曲线b)；然而相同浓度的土霉素在GS/GCE表面出现一个明显的氧化峰，峰电位位于0.58 V(曲线d)。土霉素氧化峰电流的显著提高说明GS对土霉素的氧化有显著的增敏作用，具备强的信号放大效应，从而最终使检测灵敏度显著提高。曲线(a)和(c)分别为GCE和GS/GCE在pH为7.0的PBS中的伏安曲线，未出现氧化峰，这表明0.58 V处的氧化峰由土霉素引起。

2.3 土霉素电化学检测条件的选择

图4A为pH 值对土霉素氧化峰电流的影响情况。当pH由5.5增加到7.0时，土霉素的氧化峰电流逐渐增加；继续增加pH值至8.0时，土霉素的氧化峰电流反而逐渐下降。为获得高的响应信号，测定在0.1 mol/L的pH=7.0的PBS中进行。

研究了GS修饰剂用量的影响，结果如图4B所示。当GS悬浮液的体积由0增加至4.0 μL时，土霉素的氧化峰电流显著增大，这是因为土霉素的富集效率随着GS修饰量的增加而明显提高。当GS修饰剂用量由4.0 μL增加至8.0 μL时，土霉素的氧化峰电流基本保持不变，表明土霉素在GS表面的量趋于恒定。综合考虑土霉素的氧化峰电流值与制备修饰电极所需的时间，GS修饰剂的用量选择4.0 μL。

图4C比较了不同富集电位下，土霉素的氧化峰电流变化情况。当富集电位从-0.30 V变化到0.30 V，土霉素的氧化峰电流值基本保持不变，这说明富集电位对土霉素的影响甚微。为操作方便，起始电位和富集电位都选择0.10 V。

考察了富集时间的影响。如图4D所示，当富集时间从0延长到3 min时，土霉素的氧化峰电流明显增强，表明富集时间可以有效地提高土霉素的测定灵敏度。继续延长富集时间，土霉素的氧化峰电流基本不变，这可能是由于土霉素在GS/GCE表面的富集趋于饱和。考虑到检测灵敏度和分析时间，富集时间选定为3 min。

图4 pH值(A)、GS修饰剂用量(B)、富集电位(C)和富集时间(D)对5.0×10-7 mol/L土霉素氧化峰电流的影响Fig.4 Effects of pH values(A),GS amount(B),accumulation potential(C) and accumulation time(D) on the oxidation peaks current of 5.0×10-7 mol/L oxytetracycline

2.4 方法的重现性及干扰实验

实验发现GS修饰电极不能用于土霉素的连续测定，这是因为土霉素的氧化产物强吸附所致。为此，考察了多支修饰电极之间的重现性，结果表明10支修饰电极平行测定5.0×10-7mol/L土霉素的相对标准偏差(RSD)为3.2%，说明重现好。

研究了其它物质的干扰情况，实验表明1.0×10-3mol/L的葡萄糖、蔗糖、甘氨酸；2.0×10-4mol/L的维生素C、维生素E、柠檬酸、Fe3+、Al3+与Cu2+，以及5.0×10-6mol/L的氯霉素对5.0×10-7mol/L土霉素的测定不产生干扰(峰电流变化低于5%)。

2.5 方法的线性范围和检测限

在最优条件下，考察了GS/GCE测定土霉素的线性范围与检测限。实验结果显示，土霉素的氧化峰电流值(Ipa，μA)与其浓度(c，μmol/L)在5.0×10-8～1.0×10-6mol/L范围内呈现良好的线性，回归方程为：Ipa= 2.0306c，相关系数为0.997；基于3倍信噪比计算得检测限为 1.5×10-8mol/L。

2.6 样品测定

为评价所建立方法的实用性，对服用土霉素片剂的人体尿液样品进行分析。取1.00 mL样品溶液加到9.00 mL，pH=7.0的PBS中，富集3 min后记录DPV曲线。每个样品平行测定3次，RSD低于5%，土霉素浓度由标准曲线计算得出。为评价方法的准确性，进行加标回收实验，结果见表1。加标回收率在93.6%～95.8%之间，说明该方法可用于实际样品中土霉素的测定。

表1 尿液中土霉素含量的测定

3 结论

采用NMP溶剂超声剥离制备出石墨烯纳米片，进而制备出石墨烯纳米片修饰电极。由于强的富集能力和大的表面积，石墨烯纳米片修饰电极显著提高了土霉素的氧化峰电流信号。基于NMP剥离石墨烯显著的信号增敏效应，建立了一种快速、简便、灵敏、准确的土霉素电化学检测新方法。