基于荧光染料和氧化石墨烯同步荧光法同时检测多种流感病毒亚型

陈 璐， 何治柯

(1.华中农业大学理学院化学系，湖北武汉 430070；2.生物医学分析化学教育部重点实验室，武汉大学化学与分子科学学院，湖北武汉 430072)

流感病毒是正黏液病毒科带有包膜的RNA病毒，它是很容易造成人和其它动物患流行性感冒的病原体[1]。根据病毒表面的血凝素和神经氨酸酶这两种糖蛋白的不同，可以把流感病毒分成16种H型和9种N型[2]。传统的流感病毒识别和检测方法有三种，分别为细胞培养分离病毒法、实时反转录酶联免疫吸附法和抗原-抗体免疫实验。细胞培养病毒分离法检测流感病毒比较灵敏，但耗时费力[3]。实时反转录酶联免疫吸附法检测成本比较高[4]。抗原-抗体免疫实验缺点是灵敏度不高且检测成本比较高[5]。因此，迫切需要开发一种简便有效、灵敏度高、成本较低的流感病毒检测方法。目前已经有很多化学传感方法用于检测流感病毒，比如电化学免疫法[6]、石英晶体微天平法[7]、表面等离子体共振法[8]、质谱法[9]等。虽然这些方法的检出限可以达到105～107pfu/mL，但是不能对流感病毒进行高灵敏的分型检测。荧光分析法灵敏度高，与常规荧光分析法相比，同步荧光分析法具有简化谱图、提高选择性、减少光散射等特点，尤其适合多组分样品分析[10]。

本文采用同步荧光均相免疫法对三种流感病毒H1N1、H5N1以及H9N2进行了分型和高灵敏检测。分别选择三种带有活性基团及不同荧光发射波长的荧光染料，与H1N1、H5N1以及H9N2的抗体偶联作为流感病毒的捕获探针，再与氧化石墨烯溶液混合。由于氧化石墨烯具有非常高的荧光猝灭效率[11]，三种带有病毒抗体的荧光染料的荧光被猝灭。当加入适量对应抗体的流感病毒亚型时，由于抗原-抗体免疫反应，使得氧化石墨烯远离荧光染料，染料的荧光得以回升。通过回升的荧光发射波长位置和荧光强度，实现流感病毒的定性分型和定量检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

UV-2550紫外可见分光光度计(日本，岛津公司)；RF-5301荧光光谱仪(日本，岛津公司)；赛多利斯PB-10 pH计(北京赛多利斯科学仪器有限公司)；BS110S电子分析天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)；3 K透析袋以及透析所用夹子(仕必纯贸易有限公司Spectrum Laboratories Inc.)。

三种Alexa Fluor不同发射波长的荧光染料均购自于美国Invitrogen公司。H1N1、H5N1和H9N2病毒及其抗体均由华中农业大学动物科学技术学院张万坡副教授课题组提供。实验所用其它试剂均为分析纯，水溶液均采用Milli-Q(Millipore)超纯水净水器纯化的超纯水配制。

1.2 Alexa Fluor染料标记流感病毒抗体

将0.2 mg的流感病毒H1N1抗体与0.5 mg的Alexa Fluor 488用0.5 mL的0.01 mol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH=7.4)溶解，在25 ℃条件下轻轻摇动，反应30 min后，静置过夜。然后转入3 K透析袋中透析24 h，透析液为0.01 mol/L的PBS(pH=7.4)。透析完毕后，取出透析袋中溶液于4 °C冰箱保存，以备后续使用。将此经过纯化后的染料和H1N1病毒抗体的偶联复合物命名为F1-Ab1。采用同样的方法，分别制备H5N1和H9N2抗体与另外2种Alexa Fluor荧光染料的偶联复合物，依次命名为F2-Ab2和F3-Ab3，并利用紫外-可见光谱测定，确定偶联后各个抗体的浓度。

1.3 荧光光谱测定

分别将F1-Ab1、F2-Ab2和F3-Ab3的溶液配制成1 μmol/L作为储备液备用；将氧化石墨烯(GO)配制成0.3 mg/mL作为储备液备用。采用0.01 mol/L PBS(pH=7.4)分别将H1N1、H5N1和H9N2病毒溶液稀释成一系列浓度后使用。分别取1 μmol/L的F1-Ab1、F2-Ab2和F3-Ab3溶液和不同浓度的GO溶液定容到500 μL，于470 nm激发波长下测定同步荧光光谱。不同体积的三种流感病毒亚型溶液分别加入到F-Ab和GO的水溶液中，同样定容到500 μL，于470 nm激发波长下测定同步荧光光谱。

2 结果与讨论

2.1 实验原理

图1 基于荧光染料标记的抗体和氧化石墨烯检测H1N1、H5N1和H9N2三种流感病毒亚型原理图Fig.1 Schematic illustration of the F-Ab and GO based H1N1,H5N1 and H9N2 biosensor

如图1所示，三种流感病毒亚型的抗体和荧光染料的偶联物与GO混合在一起时，由于GO具有很强荧光猝灭能力，荧光染料的荧光被GO猝灭。当三种流感病毒加入时，抗体与病毒相互作用，使得与抗体偶联的荧光染料远离GO，荧光得以恢复，通过恢复的荧光强度实现对流感病毒亚型的定量检测。

2.2 氧化石墨烯对F-Ab的荧光猝灭

考察了GO对F1-Ab1的荧光猝灭能力。如图2a所示，当GO的浓度在0～10 ng/mL范围内变化时，其对F1-Ab1的荧光猝灭呈线性关系。而当GO的浓度大于70 ng/mL时，荧光不再猝灭，表明GO已经达到饱和值。同理考察了GO对F2-Ab2(图2b)及F3-Ab3(图2c)的荧光猝灭能力，其线性范围均为0～10 ng/mL。随着GO浓度的增大，荧光猝灭能力增强，GO饱和浓度分别为70 ng/mL(F2-Ab2)和40 ng/mL(F3-Ab3)。

图2 氧化石墨烯对病毒抗体标记的荧光染料荧光强度的影响Fig.2 Changes in the synchronous fluorescence spectra of virus antibody labeled organic dyes with increasing concentration of GO(0,2.4,4.5,5.5,7.5,8.5,10,12,20,30,40,50,60,70 ng/mL) towards F1-Ab1 (2a); 0,3,5,8,10,15,22,30,40,50,60,70 ng/mL GO towards F2-Ab2(2b); 0,2,5,7,10,15,20,30,40 ng/mL GO towards F3-Ab3(2c).Inset:the curve of quenched fluorescence intensity of F-Ab upon increasing concentration of GO,the detection conditions are all in 15 mmol/L PBS buffer with excitation wavelength 470 nm.

2.3 实验条件优化

2.3.1波长差的选择考察了同步扫描荧光法中发射波长和激发波长之间的波长差△λ对实验结果的影响。由于荧光染料Alexa Fluor的斯托克斯位移为20 nm，所以以第一种荧光染料Alexa Fluor 488的同步荧光强度作为优化实验条件的参照标准，考察了△λ在 5～25 nm之间变化时对实验结果的影响。Alexa Fluor 488的同步荧光峰最高值出现在△λ为10 nm时，因此，实验选取△λ为10 nm。

2.3.2PBS浓度的选择考察PBS浓度在5～25 mmol/L之间变化时对实验结果的影响。发现PBS浓度为15 mmol/L时，Alexa Fluor 488的同步荧光强度最大。实验选择PBS浓度为15 mmol/L。

2.3.3NaCl浓度的选择考察了NaCl溶液浓度在5～30 mmol/L之间变化时对结果的影响。实验发现NaCl浓度为15 mmol/L时，Alexa Fluor 488的同步荧光强度最大。因此，实验选择NaCl浓度为15 mmol/L。

2.4 特异性实验

图3 同步荧光法同时检测H1N1(a)、H5N1(b)及H9N2(c)三种流感病毒亚型的荧光光谱图Fig.3 Synchronous fluorescence spectra of F-Ab,GO and H1N1(a),H5N1(b) and H9N2(c) with increasing concentration concentration range:(a)1-18 ng/mL;(b) 1-18.5 ng/mL;(c) 1-16 ng/mL.

分别将H1N1、H5N1和H9N2加入到含有F-Ab 和GO的溶液中，H1N1病毒只与F1-Ab1有特异性作用，使得F1-Ab1的荧光得以恢复；H5N1病毒只与F2-Ab2有特异性作用，使得F2-Ab2的荧光得以恢复；而H9N2病毒只与F3-Ab3有特异性作用，使得F3-Ab3的荧光得以恢复，说明三种流感病毒亚型的抗体与其相应抗原的作用具有很好的特异性。

2.5 线性范围和检出限

在最佳实验条件下，对H1N1、H5N1和H9N2进行同时检测，如图3。H1N1的线性范围为1～18 ng/mL，线性方程为：Y=19.74X+5.248(R2=0.9990)，检出限为0.48 ng/mL；H5N1的线性范围为1～18.5 ng/mL，线性方程为：Y=20.08X+2.126(R2=0.9991)，检出限为0.46 ng/mL；H9N2的线性范围为1～16 ng/mL，线性方程为：Y=20.29X+0.300(R2=0.9980)，检出限为0.42 ng/mL。

2.6 干扰实验

选择了四种对照病毒：人肠道病毒EV71、柯萨奇B3、痘病毒和伪狂犬病毒，分别加入到流感病毒的检测溶液中，测量其荧光回升强度值。实验发现，这四种病毒均不会产生明显的荧光回升，而三种流感病毒的荧光回升值非常明显，说明其它病毒对本检测方法不会造成干扰。

2.7 方法的实际应用

将此荧光探针加入到病毒样品中进行检测，效果并不理想。其原因可能如下：(1)病毒样品中含有大量蛋白质和其它分子，它们很容易吸附在GO表面，从而干扰样品的测定。(2)检测物自身也会被GO所吸附，特别是结构简单、分子量小的蛋白质，因吸附在GO表面而影响检测效果，因此在实验过程中需要通过超声、振荡等方式消除目标物和GO之间的非特异性吸附。(3)由于荧光探针是利用荧光染料制备而成，荧光染料在一定的pH环境下带有电荷，同样会与GO表面的活性基团产生物理作用，从而影响实验效果[12]。因此，利用GO作为荧光猝灭剂而建立的荧光分析法需进一步改进，以提高复杂样品中目标物的检测效果。

3 结论

建立了一种基于荧光染料和氧化石墨烯的均相免疫法，并用于同时检测三种流感病毒亚型H1N1、H5N1和H9N2，其检出限分别为0.48 ng/mL、0.46 ng/mL及0.42 ng/mL。方法灵敏度高、选择性好并且操作简便快速，有望在临床诊断中用于混合样品中流感病毒筛选和同时检测，具有较好的应用前景。

致谢：感谢华中农业大学张万坡副教授课题组为本实验提供流感病毒及抗体。