磁固相萃取与胶体金免疫层析试纸条联用检测食品中氯霉素

许胜男， 余琼卫， 袁必锋， 冯钰锜

(生物医学分析化学教育部重点实验室，武汉大学化学与分子科学学院，湖北武汉 430072)

氯霉素(Chloramphenicol,CAP) 是一种广谱抗菌素，被广泛用于治疗伤寒等疾病。研究发现，如果人们长期食用含有 CAP 残留的动物源性食品，将对健康构成直接或潜在的威胁[1]。许多国家对食品中CAP 残留的最大允许检出限量(MRPLs) 低至0.3 ng/g[2]。因此，快速准确筛查食品中CAP十分重要。目前已报道的用于分析检测CAP的方法主要是高效液相色谱法(HPLC)[3 - 6]和气相色谱-质谱法(GC-MS)[7 - 9]。这些方法需要较长的操作时间和昂贵的仪器，不能满足大批量样品的快速筛查和现场检测的需要。胶体金免疫层析(GICA)试纸条(简称试纸条)正好满足了这个要求，它具有操作简单，短时间内可得到检测结果，生产成本和检测成本较低等特点。目前已经开发出检测多种食品中CAP的试纸条[10]。由于牛奶样品呈液态，可以不经过前处理直接用试纸条检测，而蜂蜜和鸡蛋等样品是粘稠状态，无法像牛奶样品一样直接进行检测，因此市场上多数是用于检测牛奶样品的试纸条，少有的用于检测蜂蜜和鸡蛋样品的试纸条的价格要比检测牛奶样品的试纸条价格高一倍。在试纸条检测前对蜂蜜和鸡蛋样品进行前处理，有望拓展检测牛奶中CAP试纸条的应用范围。

磁固相萃取(MSPE)是以磁性纳米颗粒为吸附剂的一种分散固相萃取技术。MSPE与常规固相萃取(SPE)相比，具有操作简单、萃取时间短、有机溶剂用量少、易于自动化等优点[11]。本研究制备了一种聚苯胺(Polyaniline,PANI)包裹磁性纳米Fe3O4的复合材料(MNPs)，将食品中CAP先采用聚苯胺磁性材料进行MSPE，然后再进行试纸条检测。结果表明该联用方法在扩大试纸条应用范围的同时降低了检测成本。该联用模式由于操作简单、快速，具有广泛的应用前景。

1 实验部分

1.1 液相色谱-质谱条件

液相色谱-质谱联用系统是由日本岛津LC-MS 2010EV 系列组成，包括二元泵、在线脱气装置、柱温箱、自动进样器及电喷雾-单重四极杆质谱仪。

色谱条件：色谱柱：XTerra C18柱(150×2.1 mm,i.d.,3.5 μm,美国Waters公司)；流动相：A相为水，B相为甲醇。梯度洗脱条件：0～5 min，30%B；5～8 min，70%B；8～15 min，30%B；柱温：40 ℃，流速为 0.2 mL/min。

质谱条件:电喷雾-负离子源模式(ESI-)，选择离子监测(SIM)；载气:氮气；CAP 的准分子离子(m/z)为 321，内标THAP 的准分子离子(m/z)为354。

1.2 试剂与材料

FeCl3·6H2O、乙二醇(EG)、NaAc、乙二胺(ED)、乙腈、乙醇、丙酮、苯胺、过硫酸胺均为分析纯，均购于国药集团化学试剂有限公司。氯霉素(CAP) 购于中国生物药品检定所；CAP快速检测试纸条购买于北京维德维康生物技术有限公司。实验用水为超纯水。

蜂蜜和鸡蛋均购买于武汉大学菜市场。

1.3 样品处理

称取1.0 g蜂蜜或鸡蛋样品于样品瓶中，加入10 mL水，手摇均匀，作为上样液。

1.4 聚苯胺包裹磁性纳米Fe3O4材料的制备

萃取材料的制备参照文献方法[12]，以溶剂热法合成磁性纳米Fe3O4：称取5.0 g FeCl3·6H2O,溶于100 mL EG中，加入15.0 g NaAc固体，搅拌使其溶解后，加入50 mL ED，继续搅拌30 min，使其成为均一的溶液，将溶液转移至200 mL反应釜中，于烘箱中200 ℃反应8 h。然后用水和乙醇将得到的磁颗粒清洗至上清液澄清，于真空干燥箱中60 ℃烘干，备用。聚苯胺包裹磁性纳米Fe3O4材料的合成：4.56 g过硫酸铵溶于250 mL 1 mol·L-1HCl，7.45 g苯胺溶于250 mL 1 mol·L-1HCl。将过硫酸铵溶液快速加入聚苯胺溶液中，剧烈搅拌30 s后静置24 h，然后用水和乙醇依次将得到的聚苯胺材料清洗至上清液澄清，于真空干燥箱中60 ℃烘干，备用。将240 mg聚苯胺，60 mg磁性Fe3O4置于研钵中，研磨混合均匀，即得到聚苯胺包裹磁性Fe3O4复合材料。

1.5 磁固相萃取及试纸条检测

1.5.1磁固相萃取过程磁固相萃取过程见图1。具体步骤如下：上样：称取50 mg聚苯胺包裹磁性纳米Fe3O4材料于15 mL样品瓶内，加入上样液，手动振荡1 min，在外磁场作用下分离弃去上清液；清洗：加入2 mL水，手动振荡30 s，在外磁场作用下分离弃去上清液；解吸：加入1 mL乙腈解吸，手动振荡2 min，在外磁场作用下，倒出上清液于1.5 mL离心管内，滴加溶液于点样板，用洗耳球或吹风机吹干，随后进行检测。

1.5.2试纸条检测检测步骤参照说明书，打开试纸条筒，取所需金标微孔，吸取200 μL样品溶液于金标微孔中，吹打至孔底的紫红色颗粒完全溶解，置于一定温度下，温育3 min；从对应的试纸条筒中，取出适量的试纸条，将试纸条插入温育后的金标微孔中，反应6～8 min；从金标微孔中取出试纸条，弃去试纸条下端的样品垫，然后判读结果。

结果判定(图1)：T线比C线的颜色深或T线与C线颜色一致，表示样品中不含有CAP(-)；T线比C线的颜色浅很多或没有颜色，表示样品中含有CAP(+)；若 C线不显色，表示存在不正确的操作或检测卡已失效(NE)，用新的试纸条重新检测。

图1 样品中氯霉素的磁固相萃取与试纸条检测示意图Fig.1 Schematic diagram for CAP determination

2 结果与讨论

2.1 试纸条直接检测样品中氯霉素

由于蜂蜜粘度太大，无法直接用试纸条检测。取1.0 g蜂蜜，用10 mL水稀释后用试纸条检测。如表1所示，在蜂蜜中加入的CAP浓度为0、5和10 ng/g时，检测均显示阴性。表明即使将蜂蜜稀释后检测，但试纸条的检出限太高，不适用于蜂蜜中CAP的检测。

图2 3种解吸液的解吸效果Fig.2 Extraction efficiency with different elution solvents

2.2 经过磁固相萃取后试纸条检测样品中氯霉素

2.2.1磁固相萃取解吸液的选择分别考察了甲醇、乙腈、丙酮三种解吸液对实验结果的影响，结果表明乙腈和丙酮的解吸效率相当，见图2。考虑到丙酮更容易吹干，所以选用丙酮作为解吸液。由于解吸液要完全吹干后才能进行检测，考虑到此方法应用于现场，不能用氮吹仪等特殊设备，本研究提供的方法是用吹风机或洗耳球等易携带的小工具吹干。为了缩短吹干时间，需要较少体积的解吸液， 但解吸液体积越少， 检出限越高。综合考虑， 解吸液的体积定为1 mL。

2.2.2磁固相萃取材料中MNPs和PANI质量比的选择分别考察了不同质量比的MNPs和PANI组装的萃取材料的萃取结果。如表1所示，MNPs和PANI的质量比由4∶1减小至1∶4，试纸条的检出限逐渐降低，由高于2 ng/g降至0.2 ng/g。继续减小比例，试纸条的检出限不变，仍为0.2 ng/g。所以选用质量比1∶4的比例组装磁固相萃取材料。

综合考虑材料成本及检出限两方面，选用萃取材料用量为50 mg MNPs∶PANI(1∶4)和1 mL丙酮解吸液为最优条件，在此条件下试纸条的检出限可降至0.2 ng/g，见表1。

表1 未经过MSPE处理和经过MSPE处理后试纸条的检测结果(n=3)

+:positive result;nd:not detected.

2.2.3不同批次萃取材料的萃取重现性为了考察萃取材料的重现性，采用不同批次的萃取材料进行实验。分别采用50 mg不同批次制备的萃取材料对蜂蜜中氯霉素进行磁固相萃取。三批材料结果表明氯霉素在蜂蜜中浓度0.2 ng/g以上均显示阳性，表明材料具有较好的重现性。

2.2.4方法对不同基质样品分析的可行性为了扩大试纸条的应用范围，本研究除了选用不同的蜂蜜样品，也将磁固相萃取应用于鸡蛋基质中。由表2可知，CAP在不同蜂蜜样品中浓度高于0.2 ng/g时，均显示阳性，而且在鸡蛋基质中得到相同结果，表明该方法拓展了试纸条的应用范围，使其不仅可用于牛奶样品，也可以用于蜂蜜和鸡蛋等样品。

表2 不同基质中的氯霉素检测结果(n=3)

+:positive result;nd:not detected.

图3 (A)蜂蜜样品和加标蜂蜜样品(0.2 ng/g)的色谱图；(B)鸡蛋样品和加标鸡蛋样品(0.2 ng/g)的色谱图Fig.3 (A) Chromatograms of honey sample and spiked honey sample(0.2 ng/g);(B) Chromatograms egg sample and spiked egg sample(0.2 ng/g)

2.2.5方法的准确性试验为了确认实验结果的准确性，采用液-质联用对实际样品进行检测。如图3所示，在蜂蜜样品和鸡蛋样品中均未检测到CAP，而加标样品(0.2 ng/g)均检测到CAP，结果与试纸条检测结果一致，表明方法的准确性好。

3 结论

本文结合磁固相萃取样品前处理和快速筛查的试纸条检测，建立了一种快速筛查氯霉素的方法。方法操作快速简单，用时约5 min，溶剂用量少，适用于氯霉素的现场检测。该联用方法扩大了氯霉素试纸条的应用范围同时降低了检测成本。磁固相萃取与试纸条检测结合在现场快速筛查分析领域具有良好的应用前景。