亲水相互作用色谱-串联质谱法快速测定葡萄酒中四种花青素

夏碧琪， 黄芙珍， 陈祥准， 程 洁， 沈 燕， 韩 超*

(1.温州出入境检验检疫局，浙江温州 325027；2.温州大学化学与材料工程学院,浙江温州 325035)

花青素是自然界中广泛存在于植物中的水溶性天然色素，属于类黄酮化合物，多以糖苷的形式存在，也称花色苷[1]。红葡萄酒中的花青素是从红色或黑色葡萄果皮中浸提出来的，通常以单葡糖糖苷、双葡萄糖苷和酰基等衍生物的形式存在[2]。药理学实验证实，花青素具有抗氧化性、防止DNA损坏、抗癌作用、防止心血管和神经类疾病等功能[3 - 6]。

高效液相色谱具有通用性强、灵敏度高和稳定性好等特点，已在葡萄酒花青素类物质研究中广泛应用[7]。由于花青素极性很强，在普通反相色谱柱上基本不保留，同时结构相近的花青素具有类似的紫外吸收，导致了在高效液相色谱定量分析上的局限性。亲水相互作用色谱(Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography,HILIC) 具有富含多羟基的糖链结构的强亲水特性，适用于强极性物质的分析[8,9]。本研究建立的HILIC-串联质谱(MS/MS)法，可用于葡萄酒中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、氯化葡萄糖苷芍药素、飞燕草素葡萄糖苷和氯化锦葵色素-3-O-葡糖苷4种花青素(结构式见图1)的定性定量分析。为葡萄酒产品质量监控提供技术支持。该方法前处理简单、选择性好、灵敏度高。

图1 4种花青素的结构式Fig.1 Chemical structure of four anthocyanins

1 实验部分

1.1 主要仪器

Agilent 1200 高效液相色谱仪(美国，Agilent公司)；API 4000三重四级杆质谱仪(美国，AB应用生物系统公司)；Milli-Q超纯水器(美国，Millipore公司)。

1.2 试剂与材料

矢车菊素-3-O-葡萄糖苷氯化物标准品(纯度99.4%，CAS No.7084-24-4)购自百灵威公司，氯化葡萄糖苷芍药素标准品(纯度99.2%，CAS No.6906-39-4)购自Sigma公司，飞燕草素葡萄糖苷标准品(99.1%，CAS No.6906-38-3)和氯化锦葵色素-3-O-葡糖苷(纯度98.6%，CAS No.7228-78-6)均购自Chroma Dex公司。甲醇、乙腈均为色谱纯(德国MERCK公司)；乙酸铵为色谱纯(美国Alfa Aesar公司)；其它试剂除特别说明外均为分析纯。

葡萄酒样品来自客户委托检测样品。

1.3 标准溶液的配制

分别称取花青素标准品5 mg，用甲醇溶解并转移至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，作为标准储备液。使用前根据实际需要，将储备液用甲醇稀释至适宜含量，配制混合标准工作溶液。

1.4 样品处理与净化

葡萄酒样品用甲醇直接稀释1 000倍，过0.22 μm微孔滤膜后，供HILIC-MS/MS测定。

1.5 色谱条件

色谱柱：MERCK ZIC HILIC柱(150×2.1 mm，5 μm)；流动相：A为乙腈，B为20 mmol/L乙酸铵溶液。梯度洗脱程序：0～1 min,95%～50%A;1～10 min，50%A;10～20 min,95%A;流速：250 μL/min，柱温：30 ℃,进样量：10 μL。

1.6 质谱条件

电喷雾离子源：正离子扫描；离子源温度：450 ℃；电喷雾电压：4 500 V；雾化气(GS1) 压力：344.5 kPa；辅助气压力(GS2)：275.6 kPa；气帘气压力：68.9 kPa；碰撞气CAD压力：137.8 kPa。监测模式：多反应监测(MRM)。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

将标准品配制成500 ng/mL的溶液，通过流动注射泵连续进样，调谐质谱参数。使用ESI源在正离子和负离子模式下进行全扫描以选择适当的电离方式、定性和定量离子。结果表明：在ESI源的正离子模式下，这4种花青素呈现出最佳响应，准分子离子[M+H]+是响应强度最高的离子。在确定母离子后，采用子离子扫描方式进行二级质谱分析，进一步优化碰撞能量、透镜电压等质谱参数，使各分析化合物的响应最大化。质谱参数及母离子和子离子详见表1，四种花青素化合物各有一个子离子，这与文献报道一致[10]。

表1 四种花青素的保留时间和多反应监测质谱参数

2.2 液相色谱条件的优化

图2 4种花青素MRM色谱图Fig.2 MRM chromatograms of four anthocyanins Cyanidin-3-O-glucoside(A),Peonidin-3-O-glucoside(B),Delphinidin-3-O-glucoside(C) and Malvidin-3-O-glucoside(D)

为了优化色谱分离，分别考察了色谱柱:ZORBAX Eclipse Plus C18柱(150×2.1 mm i.d.,5 μm)、Waters X Bridge TM C18柱(150×2.1 mm i.d.,3.5 μm)、Waters XselectTM HSS T3柱(150×2.1 mm i.d.,3.5 μm)、MERCK ZIC HILIC柱(150×2.1 mm i.d.,5 μm)对4种花青素的分离效果。由于花青素极性很强，在前三种反相色谱柱上基本不保留，只有在MERCK ZIC HILIC 色谱柱上有较好的保留和分离效果。为了提高灵敏度，在流动相中分别添加甲酸、乙酸、甲酸铵和乙酸铵等溶液[11,12]。实验结果表明，在添加20 mmol/L乙酸铵的流动相中各化合物具有最佳响应值，可获得较好的色谱峰形，各化合物的MRM色谱图见图2。由图2可见，四种花青素并没有完全分离，然而由于电喷雾串联质谱在多反应监测(MRM) 模式下可以同时在不同窗口下检测不同化合物，分离不佳对定量检测没有干扰。

2.3 方法的线性范围与相关系数

在优化的条件下，考察了矢车菊素-3-O-葡萄糖苷氯化物、氯化葡萄糖苷芍药素、飞燕草素葡萄糖苷和氯化锦葵色素-3-O-葡糖苷4种待测物的线性范围。结果显示，4种待测物均在1.0～50.0 ng/mL范围内具有良好的线性，相关系数均不低于0.9992。以10倍信噪比(S/N)计算该方法定量限(LOQ)，4种花青素的定量限在0.05～1.0 ng/mL之间。各化合物的线性方程、相关系数和定量限见表2。

表2 样品中4种花青素的线性方程、相关系数、定量限

2.4 标样和样品重复性试验

取同一批次的混合标准样品和葡萄酒样品，连续测定6次，在上述仪器条件下，保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD)均在2%以内。

2.5 实际样品的测定

取已知矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、氯化葡萄糖苷芍药素、飞燕草素葡萄糖苷、氯化锦葵色素-3-O-葡糖苷含量分别为0.58、2.21、3.12、22.1 mg/L的葡萄酒样品，平行6份，然后分别精确加入矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、氯化葡萄糖苷芍药素、飞燕草素葡萄糖苷、氯化锦葵色素-3-Β-葡糖苷浓度分别为0.5、2.0、2.0、20.0 mg/L 的标准溶液1 mL，按照本方法进行测定，计算回收率，平均回收率为93.1%～96.7%，RSD不大于5.2%。应用本方法对客户委托的10个不同红葡萄酒样品进行了分析测定。每一个样品均测定了三个平行，测定结果列于表3中。结果显示，各花青素在不同样品中的含量情况差异较大，其中氯化锦葵色素-3-O-葡糖苷在各个样品中的含量都最高。

表3 红葡萄酒样品中四种花青素含量及相对标准偏差(n=3)

3 结论

本文建立了亲水相互作用色谱-串联质谱法快速测定葡萄酒中4种花青素的分析方法。样品经甲醇稀释后以Merck ZIC HILIC色谱柱(150×2.1 mm,3.5 μm)分离,乙腈-20 mmol/L乙酸铵溶液作为流动相，梯度洗脱,目标物在多反应监测(MRM)模式下检测，外标法定量，方法无需固相萃取净化、浓缩等复杂操作步骤，即可得到准确测定结果。该方法简便、准确、灵敏，可满足葡萄酒中4种花青素同时定性定量分析的要求。