超高效液相色谱-电喷雾串联四级杆质谱法快速测定烟草中8种植物生长调节剂残留

师君丽*， 孔光辉， 逄 涛， 李 勇， 刘彦红

(云南省烟草农业科学研究院，云南玉溪 653100)

植物生长调节剂(Plant Growth Regulators，PGRs)是人工合成的具有植物激素活性的一类物质，它们在较低浓度下即可对植物的生长发育表现出调节作用[1,2]，但植物生长调节剂施用不当会在农作物中造成残留，给人体带来危害。中国、美国、欧盟、日本等国家对此类物质制订了严格的限量要求，如我国规定苹果和番茄中萘乙酸的最大残留限量为0.1 mg/kg[3]；欧盟食品法规规定新鲜番茄中烯效唑的最大残留限量为0.01 mg/kg；日本规定蔬菜中萘乙酸的最大残留限量为0.1 mg/kg。现在植物生长调节剂在烟草生产中已有使用，因此，对烟草中植物生长调节剂残留的检测显得尤为重要。

目前，植物生长调节剂的检测方法主要集中在果蔬上，报道的方法有气相色谱法(GC)[4]、气相色谱-质谱法(GC-MS)[5]、高效液相色谱法(HPLC)[6 - 8]、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[9 - 13]，而有关烟草中其检测方法未见报道。HPLC法虽可以测定多数植物生长调节剂，但不能满足欧盟等国制定的残留限量要求，且不能提供结构方面的信息，不能完成对目标化合物的确证工作，因而在实际应用中受到很大的限制。将超高效液相色谱(UPLC)-MS/MS法应用于植物生长调节剂的残留分析，不仅可以实现对多种植物生长调节剂的快速测定和结构确证，还能满足复杂基质样品的痕量检测要求。

本文建立了烟草中比久、多效唑、烯效唑、矮壮素、萘乙酸、2，4-D、赤霉素、脱落酸8种植物生长调节剂残留的UPLC-ESI MS/MS分析方法，该方法具有操作简便、快速、灵敏度高和选择性好等优点。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

ACQUITY UPLC超高效液相色谱(美国，Waters公司)；AB Sciex QTRAP 5500 质谱仪(美国，AB Sciex公司)；Millipore Simplicity超纯水机(美国，Millipore公司)；Eppendorf 5804高速离心机(德国，Eppendorf公司)；Talboys数显型多管式旋涡混合器(上海安谱科学仪器公司)。

标准品：赤霉素、萘乙酸、比久、多效唑、烯效唑、矮壮素、2，4-D(纯度均大于98%，德国Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司)，脱落酸(纯度大于99%，美国Sigma公司)。乙腈、甲醇、乙酸铵、甲酸均为色谱纯(美国Fisher公司)。C18散装吸附剂和PSA散装吸附剂(美国Agilent公司)。实验用水为超纯水。

1.2 样品提取与净化

烤烟样品40 °C烘干，粉碎后过60目筛。准确称取烟样2 g于50 mL具盖离心管中，加入10 mL乙腈，漩涡振荡2 min，超声15 min，以6 000 r/min离心3 min。移取上清液1 mL至1.5 mL离心管中，加入50 mg C18分散吸附剂，旋涡振荡2 min，以6 000 r/min 离心2 min。吸取上清液200 μL，加入800 μL乙腈，过0.22 μm有机相滤膜后上机分析。

1.3 仪器条件

1.3.1色谱条件色谱柱：ACQUITY UPLC®HSS T3柱(100×2.1 mm ，1.8 μm)；柱温：30 ℃；进样量：2 μL；流速0.3 mL/min。流动相A:甲醇，流动相B:5 mmol/L乙酸铵溶液，梯度洗脱：0～0.5 min，5%A；0.5～4 min，5%～100%A；4～6 min，100%A；6～7 min，100%～5%A；7～8 min，5%A。

1.3.2质谱条件电离方式：电喷雾ESI；扫描方式：正/负离子扫描；监测方式：多反应监测(MRM)；正离子模式电喷雾电压：5 000 V，负离子模式电喷雾电压：-4 500 V；雾化气压力：0.344 MPa；气帘气压力：0.241 MPa；辅助加热气压力：0.379 MPa；离子源温度：600 ℃。8种化合物质谱参数见表1。

表1 8种化合物的质谱采集参数

*quantification transition；DP：declustering potential；CE：collision energy.

2 结果与讨论

2.1 质谱条件优化

分别取单一标准溶液，采用流动注射的方式以10 μL/min的流速将单一标准溶液注入离子源，在正离子和负离子模式下进行全扫描以选择合适的分子离子峰和电离方式。结果表明，在电喷雾正离子模式下，矮壮素、烯效唑、多效唑全扫描的分子离子[M+H]+最理想，在负离子模式下，赤霉素、萘乙酸、丁酰肼、脱落酸、2，4-D全扫描的分子离子[M-H]-最理想。分别对分子离子峰进行子离子扫描，得到二级碎片离子信息，选择丰度相对较高和相对分子质量较大的碎片离子，优化锥孔电压、离子源温度和碰撞能等参数，使8种化合物特征碎片离子的灵敏度达到最大。优化出的结果见1.3.2节。

2.2 液相色谱条件的选择

比较了乙腈-水和甲醇-水两种流动相对目标化合物信号强度的影响，结果表明以甲醇为有机相时，各组分的信号强度比较稳定，而以乙腈为有机相时的信号强度明显降低。可能是甲醇为质子给体溶剂，有利于目标化合物产生正离子，而乙腈是受体，不如甲醇优越。

进一步研究流动相中加入一定量的乙酸铵和甲酸对目标化合物离子化效率的影响。实验发现，在流动相中加入乙酸铵有助于改善峰形，加入0.1%甲酸有助于正离子模式下待测物母离子峰的形成，但会抑制负离子模式下待测物母离子的响应。实验对比了甲醇和不同浓度的乙酸铵溶液作流动相时各目标物的响应，结果显示，用甲醇-5 mmol/L乙酸铵溶液作流动相时，各目标化合物的信号强度较稳定、峰形较好、灵敏度较高。

优化色谱-质谱条件下8种植物生长调节剂的色谱图见图1。

图1 8种植物生长调节剂的MRM色谱图Fig.1 Chromatograms of 8 plant growth regulators by MRM

2.3 前处理条件的优化

2.3.1提取溶剂的选择比较了以甲醇、乙腈、水、甲醇-水(体积比1∶1)为提取溶剂时，8种目标化合物的提取效率。结果表明，甲醇-水(1∶1)和水作为提取溶剂时乳化现象较严重，乙腈提取液干扰物较少，且效率最高。进一步比较了2%氨水的乙腈溶液、2%甲酸的乙腈溶液作为提取液的提取效果，发现提取液的酸碱度对8种植物生长调节剂的提取效率无明显差异。

此外实验对比了QuEChERS 提取方法：加入10 mL乙腈振荡后，再加入4 g无水MgSO4，1 g NaCl，1 g 柠檬酸钠和0.5 g柠檬酸氢二钠提取。实验结果表明，该方法与直接加入乙腈提取的效果无明显差异，结合分析时间和成本考虑，实验选用乙腈作为提取溶剂。

2.3.2提取方法的选择实验对提取方法进行了比较。分别试验了漩涡振荡2 min后不超声，以及分别超声10 min、15 min、20 min和30 min。结果发现，随超声时间的延长，各待测物的提取量逐渐增大，当超声时间为15 min时，各待测物的提取量最大，继续延长超声时间，各待测物的提取量不再增大，因此选择加入乙腈后超声15 min。

2.3.3吸附剂的选择及用量分别称取50、100、150、200 mg的C18吸附剂和PSA吸附剂于2.0 mL 离心管中， 分别加入1 μg/mL的8种生长调节剂基质标准溶液各1.5 mL， 考察2种吸附剂对8种植物生长调节剂的回收率影响和净化效果。实验结果表明：PSA作为弱阴离子交换剂，对脂肪酸、有机酸、有机碳水化合物等极性化合物有较强的吸附作用，它的吸附作用随着吸附剂用量增加而加强，因此除杂较净，但对极性目标化合物丁酰肼、矮壮素、萘乙酸和脱落酸的回收率均低于55%。C18对脂类具有较好的净化效果，对8种生长调节剂有较好的回收率，随着吸附剂用量增加，除杂效果和8种目标物的回收率并无明显变化。综合考虑两种吸附剂的去杂质效果和对目标化合物的吸附情况，选择50 mg C18吸附剂对提取液进行净化。

2.4 标准曲线、方法的回收率和检出限

采用烟草空白基质配制0.005、0.01、0.02、0.05、0.1 mg/L 5个浓度梯度的混合标准工作溶液， 以浓度(X)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线，在0.005～0.1 mg/L范围内，各标准品浓度与峰面积值均有良好的线性关系(表2)。选用烟草空白基质，分别在0.005、0.01、0.05 mg/kg三个添加水平下进行加标回收试验，每个水平重复5次，回收率和相对标准偏差(RSD)见表2。结果表明，在3个加标水平上，8种植物生长调节剂的回收率为85.4%～103.1%，相对标准偏差为2.4%～6.2%，检出限为0.001～0.004 mg/kg。

表2 8种植物生长调节剂的回归方程、相关系数、回收率、相对标准偏差和检出限

2.5 实际样品分析

利用本方法对收集到的60个样品进行了检测。检测结果显示，所有样品均检出脱落酸，其余7种植物生长调节剂均未检出，样品中脱落酸含量为0.787～1.927 mg/kg，原因为脱落酸是植物内源激素之一。

3 结论

建立了烟草中8种植物生长调节剂的UPLC-ESI MS/MS分析方法，样品采用乙腈提取，经过C18分散吸附剂净化，电喷雾正负离子模式下分析检测。8种植物生长调节剂的检出限为1～4 μg/kg，添加回收率为85.4%～103.1%，相对标准偏差为2.4%～6.2%，完全能够满足残留限量要求。该方法操作简单、灵敏度高、选择性和稳定性好，且分析时间短，是一种快速、准确测定烟草中8种植物生长调节剂的分析方法。