基于Pt-Ni合金纳米管修饰免疫传感器的研制

常艳兵， 冯亚娟， 杨晓丽， 何 琼

(曲靖师范学院化学化工学院，云南曲靖 655011)

甲胎蛋白(AFP)是胚胎发育早期的一种主要血清蛋白[1]，它在机体内具有许多重要的生理功能，如运输、作为生长调节因子等。在病理状态下,甲胎蛋白与原发性肝癌、肺癌、睾丸肿瘤等相关，因此，临床上AFP常被用作胎儿缺陷和肿瘤的血清标志物,对于辅助诊断及疾病监测有重要的价值[2,3]。目前AFP的检测方法主要有色谱分析法、酶联免疫吸附分析法(ELISA)[4]、荧光分析法[5]、放射免疫测定法(RIA)、间接血凝法及琼脂双扩散法等。这些方法灵敏高、可靠性强，但大部分需要对抗原或抗体进行放射性标记，具有放射性危害，且操作复杂，所用仪器设备昂贵。利用电化学方法检测免疫反应具有检出限低、灵敏度高、操作简便、仪器设备价廉等优点而逐渐成为研究的热点[6 - 9]。

Pt纳米材料因具有较高的催化活性、较强的吸附能力和生物相容性，且容易修饰等特性，因而被广泛用于生物分子的固载和电极的修饰；Ni纳米材料能够增加酶的活性，实现酶的直接电化学检测，结合Pt、Ni双金属纳米材料各自的优点可极大地提高免疫传感器的灵敏度[10 - 12]。本文利用恒电位沉积法制得Pt-Ni合金纳米管，将其修饰到玻碳电极上制成免疫传感器。用该免疫传感器来测定甲胎蛋白，结果表明具有电流响应高、灵敏度好、性能稳定等优点。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

CHI660C电化学工作站(上海辰华仪器公司)；XL30ESEM-TMP扫描电镜(荷兰，飞利浦有限公司)；GenesisXMX X射线能谱仪(美国,伊达克斯有限公司)；pHS-3C型pH计(上海虹益仪器仪表有限公司)；SK2200H超声波清洗器(上海科导超声波仪器有限公司)；工作电极为Pt-Ni合金纳米管修饰的玻碳电极。

甲胎蛋白测定诊断试剂盒(Diagnostic kit for Alpha-feto-protein，AFP，北京博奥森生物技术有限公司)；多孔聚碳酸酯模板(PC，0.2 mm，美国沃特曼公司)；H2O2(上海化学试剂公司)；Ni(NO3)2·6H2O(广东光华化学厂有限公司)；H2PtCl6·6H2O)(上海精细化工材料研究所)；0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH=6.8)由Na2HPO4和KH2PO4配制。实验所用试剂均为分析纯，水为二次重蒸水。

1.2 实验方法

1.2.1玻碳电极的预处理玻碳电极先用金相砂纸打磨，然后在毛皮上用不同粒度的Al2O3粉末进行抛光，用水洗净后，依次用HNO3(1+1)、丙酮和水各超声洗涤5 min，在空气中晾干，待用。

1.2.2工作电极的制作为了使模板具有良好的导电性，在聚碳酸酯(PC)模板的一面溅射上约50 nm厚的金层。取一块已喷金的PC模板，用导电胶将铜丝与PC模板喷金的一面粘在一起，作为工作电极。为了排除模板孔内的空气和杂质，制得排列整齐有序的纳米管，使用前需将粘有喷金PC模板的工作电极超声清洗3 min。

1.2.3电沉积法制备Pt-Ni合金纳米管先用王水洗净实验用的玻璃器皿，取5 mL 2.0×10-3mol/L Ni(NO3)2溶液，0.5 mL 3.862×10-2mol/L H2PtCl6·6H2O溶液和1 mL 1 mol/L KCl溶液于小烧杯中，混合均匀。将制作好的工作电极、饱和甘汞电极和铂电极置于烧杯混合液中浸泡20 min，使PC膜板充分浸泡，电解液进入孔内，润湿内壁。然后接通电源，在-0.30 V的恒电位下沉积30 min。取出沉积模板依次用乙醇、水进行清洗，自然晾干。

1.2.4Pt-Ni合金纳米管修饰的免疫传感器的制备取10 μL壳聚糖乙酸溶液(m/V=0.5%)滴于预处理好的玻碳电极上，剪一块沉积有Pt-Ni合金的圆形PC模板(Φ=3 mm)贴于其表面。用氯仿和乙醇(体积比为1∶1)的混合液溶解模板后，用水清洗晾干。取5 μL甲胎蛋白抗体(AFP Ab)滴于修饰好的电极上，干燥后用0.5 mol/L NaCl溶液和水洗涤3次，在0.1 mol/L甘氨酸中于25 ℃恒温封闭30 min，封闭未结合抗体的Pt-Ni合金纳米管的活性位点。每次检测前先在一定量的AFP抗原(AFP Ag)溶液中于25 ℃ 恒温培育30 min，然后在酶标抗体(AFP Ab/HRP)中于25 ℃恒温培育30 min，即制得无试剂型酶膜修饰的免疫传感器。每次培育完均用0.5 mol/L NaCl溶液和水清洗，即可用于检测。

2 结果与讨论

2.1 Pt-Ni合金纳米管的表征

制得Pt-Ni合金的扫描电镜(SEM)见图1，可以看出Pt-Ni合金成管状，排列整齐、均匀，直径和长度均在纳米范围内。通过能谱分析仪对Pt-Ni合金进行分析(图2)，从图中可以看出，合金由Pt和Ni两种主要元素组成，且含量固定，合金中含Pt量高于Ni。

图1 Pt-Ni合金纳米管的扫描电镜(SEM)图Fig.1 SEM images of the Pt-Ni alloy nanotubes

图2 Pt-Ni合金纳米管的X射线能谱(EDS)图Fig.2 EDS of the Pt-Ni alloy nanotubes

2.2 免疫传感器的循环伏安行为

图3为免疫传感器在-0.6～+0.6 V之间，扫描速度为100 mV/s时的循环伏安行为。在0.1 mol/L pH值为6.8的PBS中，未加入H2O2时，传感器产生一个较低的背景电流(图3-a)；当加入H2O2(9.9×10-3mol/L)时，其氧化峰电流急剧增加(图3-b)，证实了标记在抗体上的HRP酶的催化作用。

同时，通过实验比较了裸玻碳电极与Pt-Ni合金纳米管修饰的免疫传感器对H2O2的电流响应，裸玻碳电极对H2O2几乎没有电流响应，而Pt-Ni合金纳米管修饰的免疫传感器对H2O2的电流响应急剧增加，证明Pt-Ni合金纳米管提高了甲胎蛋白抗体在电极上的固定量，具有很强的吸附能力及催化和直接电子传递作用。

2.3 实验条件的优化

2.3.1pH值对免疫传感器的影响pH值对该免疫传感器的影响如图4所示。实验发现:该传感器在不同pH值的PBS中有不同的响应电流信号，当pH值从5.6增加至6.8时，响应电流信号不断增强，但从6.8以后随着pH的增大响应电流信号反而逐渐减小。因此，本实验选择pH值为6.8的PBS作为检测底液。

图3 免疫传感器在不同溶液中的循环伏安图Fig.3 Cyclic voltammogram of immunosensor at different solusion a:0.1 mol/L PBS(pH=6.8)；b:PBS(pH=6.8) containing 9.9 mmol/L H2O2.

图4 pH对免疫传感器的影响Fig.4 Effect of pH on the immunosensor

2.3.2培育时间对免疫传感器的影响考察了培育时间对该传感器的影响。将修饰有抗体的免疫传感器置于60 ng/mL抗原溶液中，分别培育5、10、30和50 min后，在含有H2O2(9.9×10-3mol/L)的PBS(pH=6.8)中，用计时电流法测定其响应电流。实验发现，随着培育时间的增加，响应电流不断增大，当培育时间为30 min时，响应电流值最大，之后随着培育时间的增长响应电流基本趋于稳定，说明此时免疫反应已基本完成，传感器上结合的抗原量达到饱和。因此，本实验选择30 min为最佳培育时间。

2.4 免疫传感器的响应特性

在最优实验条件下，采用计时电流法测定免疫传感器对AFP的计时响应电流和校正曲线。实验表明，当AFP的浓度范围为20～100 ng/mL时，其响应电流与抗原浓度成线性关系(图5)，线性回归方程为：i(μA)=0.216+7.375×10-3c，检出限为0.38 ng/mL，低于文献报道的0.5 ng/mL[6]。在PBS(pH=6.8)中加入100 μL(1.0 mol/L)H2O2时，随着抗原浓度的增大，计时电流响应也随着增大，原因是随着抗原浓度的增大，结合的酶标抗体的量增大，进而使催化H2O2，产生的还原电流增大。

图5 免疫传感器在不同抗原浓度下的校正曲线Fig.5 The calibration curve of immunosensor in different AFP concentration

2.5 样品测定

向所采集的健康者新鲜血清中加入AFP配制成不同浓度的测试样品，将该免疫传感器置于3个浓度的测试样品中培育30 min 后，按实验方法进行检测，结果列于表1。结果表明，回收率较好，说明本传感器可用于血清样品中AFP的测定。

用该免疫传感器对7份血清样品(由曲靖市第一人民医院提供)进行检测，并将检测结果与该院用放射免疫测定法(RIA)结果进行了比较，两种方法的结果基本一致，符合率为 91.5%，表明该免疫传感器能用于临床上血样中AFP的检测。

表1 AFP免疫传感器的回收结果

3 结论

本文利用恒电位沉积法制得Pt-Ni合金纳米管，结合Pt和Ni两种纳米材料具有较高的催化活性、较强的吸附能力和生物相容性，将其修饰到玻碳电极上制成免疫传感器。用该免疫传感器来测定甲胎蛋白，结果表明具有电流响应高、灵敏度好、性能稳定等优点。