α-葡萄糖苷酶抑制剂和葡萄糖苷酶的作用机制研究

王文,王金虎，张小康，赵祥妤

(枣庄学院a.化学化工与材料科学学院；b.美术与艺术设计学院，山东枣庄　277160)



α-葡萄糖苷酶抑制剂和葡萄糖苷酶的作用机制研究

王文a,王金虎a，张小康a，赵祥妤b

(枣庄学院a.化学化工与材料科学学院；b.美术与艺术设计学院，山东枣庄277160)

α-葡萄糖苷酶是水解碳水化合物的关键酶，抑制α-葡萄糖苷酶的活性能够抑制餐后高血糖.α-葡萄糖苷酶抑制剂可以延缓肠道碳水化合物吸收,是一种比较成熟的治疗糖尿病药物.为了发现新的具有更好治疗效果的α-葡萄糖苷酶抑制剂，对于α-葡萄糖苷酶抑制剂与α-葡萄糖苷酶的作用机制的研究变得尤为重要.本文主要采用分子对接的方法，研究了几种α-葡萄糖苷酶抑制剂与α-葡萄糖苷酶的结合模式和作用机制，明确了可能的结合位点.同时，基于对接结构设计了两种具有潜在活性的抑制剂分子，为实验上α-葡萄糖苷酶抑制剂的研究提供了理论基础.

糖尿病；葡萄糖苷酶；抑制剂；分子对接；活性位点①

0　引言

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一种以高血糖为特征，由于脂肪和蛋白质代谢紊乱导致胰岛素分泌不足或胰岛素生物作用受限的代谢性疾病.高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起[1,2].糖尿病已被国家列为“新药创制科技重大专项”的十大类重大疾病之一，研究开发新型糖尿病治疗药物迫在眉睫.

糖尿病的主要危害是高血糖导致多系统、多脏器并发症的发生，多脏器并发症是糖尿病引起死亡及残疾的主要原因.血糖的主要来源是食物中的糖类，日内最大血糖波动和餐后血糖的波动是造成糖尿病患者血管内皮损伤的重要因素.碳水化合物经过α-葡萄糖苷酶催化水解后，只有生成单糖才能被吸收，而催化水解碳水化合物的α-葡萄糖苷酶主要分布于小肠黏膜上，其包含有蔗糖酶、乳糖酶、麦芽糖酶、α-淀粉酶和α-糊精酶等[3-6].

酶是指具有生物催化功能的高分子物质，在酶的催化反应体系中，反应物分子被称为底物，底物通过酶的催化转化为另一种分子.几乎所有的细胞活动进程都需要酶的参与，以提高效率.酶在生命活动中发挥着重要作用，对身体代谢起到重要的调节作用.因此α-葡萄糖苷酶是调节食物来源血糖的关键酶，成为调控餐后血糖的作用靶酶，α-葡萄糖苷酶抑制剂是控制餐后血糖的对症治疗药物.

1　数据收集

1.1抑制剂分子的获取

本文中首相选的是目前临床上主要应用的α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物：阿卡波糖、米格列醇和伏格列波糖，主要结构如图1所示.

图1　抑制剂小分子结构：(a)阿卡波糖 (b)米格列醇 (c)伏格列波糖

(1) 阿卡波糖选用此α-葡萄糖苷酶晶体结构(PDB code: 3W37，如图1所示)来提取阿卡波糖抑制剂分子.

(2) 米格列醇 结构与葡萄糖相似，能够可逆地竞争性抑制假单糖α-葡糖苷酶.选择在此文献中出现的α-葡萄糖苷酶晶体结构(PDB code: 3L4W，如图2所示)来提取米格列醇抑制剂分子.

图2　两种α-葡萄糖苷酶晶体结构：(a)3W37; (b)3L4W

(3) 伏格列波糖 运用GaussView程序构建抑制剂小分子，再应用Gaussian软件进行优化，得到能量低、合理的稳定构型.对每种配体分子所有可能的构型进行优化后，选取能量最低的构象作为分子对接中的配体结构.

此外还通过查找其他文献[7]，获取了其它三种α-葡萄糖苷酶抑制剂来进行进一步的研究，如图3所示.这三种结构分别是：表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)和没食子儿茶素没食子酸酯(GCG).

图3　(a)表没食子儿茶素没食子酸酯; (b)表儿茶素没食子酸酯;

1.2设计的抑制剂分子

研究认为这些抑制剂分子的活性差异有可能是由于侧链官能团的变化引起的.因此，若改变抑制剂分子结构或者改变抑制剂分子的个别官能团，可能对抑制剂分子与蛋白质的结合产生影响.基于这种想法，在原有分子的基础上设计了两个可能具有抑制活性的潜在分子，如图4所示.

如图4所示，(a)结构是在原有EGCG结构基础上将编号为1的羟基(如图3所示)加上氯原子，将其命名为EGCG-Cl.(b)结构是在EGCG结构基础上将编号为1的羟基换成氨基，将其命名为EGCG-NH2.

为进行进一步研究，将对所有分子结构进行优化，以便产生更合理键长和分子间作用力的适合分子结构.

在美国国立生物信息技术中心(NCBI)的PDB数据库中用protein blast方法搜寻同源性最高的蛋白质序列，发现Gaetano speciale[8]等人正在研究的蛋白质α-葡萄糖苷酶晶体结构(PDB code:5AED).在此结构上，找到其活性位点残基：Q288、D405、D472、Y508和H537(如图5所示).本文中所有的抑制剂分子与蛋白质分子的对接若无额外说明，均用此活性位点来进行分子对接.

1.3分子模型的构建和优化

抑制剂分子：应用Gaussian软件进行分子优化，对每种配体分子所有可能的构型进行优化后，结构键长及能量等更加稳定，选取能量最低、结构最合理的构象作为分子对接中的配体结构.

蛋白质分子：该晶体结构是结合体，对接计算之前首先移除晶体结构中的水分子，然后应用Gaussian软件优化蛋白质分子(5AED)，删掉复合结构中的配体分子，最后发现其活性位点位于A链，于是就只选取处理后的A链作为受体结构，如图5所示.

图5　分子对接晶体结构：(a)α-葡萄糖苷酶晶体结构(5AED)A链；(b)活性位点

1.4分子对接

在进行分子对接时，首先是应用Gaussian软件对蛋白质分子进行进一步的优化，主要是打开蛋白质后进行加电荷和加极性氢原子等一系列相关处理.完成后，再应用这一软件中的Ligand模块对抑制剂分子进行进一步的扭转角度和去电荷等优化，并且设置配体分子的自由度.抑制剂分子及蛋白质分子进一步处理完成后，应用该软件对配体抑制剂分子和受体蛋白质分子进行对接模拟.过程中保持受体蛋白质刚性，配体分子中所有可旋转键都通过AutoDock中的Ligand模块设置为柔性，并且对配体和受体分子添加Auto Dock默认的电荷.并用Grid盒子来确定对接区域，即活性位点残基所在的区域.蛋白质分子(5AED)选取的活性位点残基为Q288、D405、D472、Y508和H537.设定特殊的Grid盒子使其能够完全包含活性位点及其周围的蛋白区域，最后确定了Grid.盒子的大小为(x-dimension 18，y-dimension 12，z-dimension20)，(x-center 53.462，y-center 23.696，z-center 3.750).

2　结果与讨论

2.1现有抑制剂的对接结果及分析

2.1.1阿卡波糖的对接结果与分析

图6呈现的这种构象就是抑制剂分子阿卡波糖(ACR1001，晶蓝色)与蛋白质分子(PDB代码5AED，晶蓝色)经处理后进行对接，然后与原来含有阿卡波糖分子(ACR1001，灰白色)的蛋白质分子(3W37，灰白色)进行序列对比的结果.这是对接最稳定的一种构象，结合能最低，为-6.8 kcal/mol.

图6　(a)阿卡波糖分子的对接结果(晶蓝色)与蛋白质分子3W37(灰白色)的序列对比结构；(b)阿卡波糖分子(球状)结构平面图.

在图中可以看到，抑制剂分子阿卡波糖可以很好的与活性位点结合，与残基Q288、D405、Y508和H537进行相互作用.其中阿卡波糖分别与残基Q288和Y508形成氢键，键长分别为2.62 Å和1.82 Å；与残基Q288和D405产生静电作用.在蛋白质分子3W37中，残基W329形成了一个疏水性的屏障，存在空间位阻，以至于蛋白质分子3W37中的2基团远离此屏障.而在阿卡波糖分子的对接结果的结构中，与阿卡波糖进行对接的是蛋白质分子5AED.蛋白质分子5AED与蛋白质分子3W37的总体结构不同，周围的残基位置和空间形状也有所不同.所以在蛋白质分子5AED中没有残基W329形成的屏障，不存在空间位阻，则使得阿卡波糖对接结构中的1基团可以进入此空间.

2.1.2米格列醇的对接结果与分析

图7呈现的就是抑制剂分子米格列醇(MIG1001，晶蓝色)在与蛋白质分子(5AED，晶蓝色)经处理后进行对接，然后与原来含有米格列醇(MIG1001，灰白色)的蛋白质分子(3L4W，灰白色)进行序列对比的结果.这种构象是对接最稳定的一种构象，结合能最低，为-5.3 kcal/mol.

图7　(a)米格列醇分子的对接结果(晶蓝色)与蛋白质分子3L4W(灰白色)的重叠结构； (b)米格列醇分子(球状)结构平面图.

在图中可以看到，抑制剂分子米格列醇分别与残基D405和Q288产生静电作用；与残基Y508形成疏水作用；与残基Q288、D405和A472相互作用形成了氢键.抑制剂分子与残基Q288形成键长为1.83 Å和2.94 Å；与残基D405形成的键长为2.31 Å和2.97 Å；与残基D472形成的键长为2.24 Å.这些氢键键长较短，形成的构象较稳点，且这些残基的位置似乎形成了一个特异性的活性口袋，将抑制剂小分子米格列醇包围在其中间，使米格列醇能更好的与活性位点结合.蛋白质分子5AED与蛋白质分子3L4W的总体结构不同，周围的残疾位置和空间形状也有所不同.

2.1.3伏格列波糖和GCG与晶体结构的对接结果与分析

图8(a)和图8(c)呈现的是抑制剂分子伏格列波糖(RES1)与蛋白质分子(5AED)的对接结果，图8(b)和图8(d)图呈现的是抑制剂分子GCG(RES1)与蛋白质分子(5AED)的对接结果.这两种分子的对接结果均选择的是结合能最低的构象，伏格列波糖分子的对接结合能分别为-5.9 kcal/mol，GCG分子的对接结合能为-9.0 kcal/mol.

在图中可以看到，这两种抑制剂分子的对接结果显示都能够很好的进入活性口袋与活性位点相结合.伏格列波糖分子与残基D405和D472形成静电作用；与残基Y508形成疏水作用；与残基D472形成了氢键，键长分别为2.22 Å和2.39 Å.GCG分子与残基Y508形成疏水作用；与残基D405和D472形成静电作用；与残基Q288和H537形成了氢键，键长分别为1.78 Å和2.84 Å.两个构象的氢键键长都比较短，作用较强，可见活性位点寻找的较为准确.

2.2基于设计的抑制剂分子的结果与分析

2.2.1EGCG-Cl分子的对接结果与分析

图9呈现的是设计的EGCG-Cl分子(RES1，晶蓝色)与蛋白质分子5AED的对接结果和EGCG分子(RES1，灰白色)与蛋白质5AED分子的对接结果进行序列对比的结果.研究所选的抑制剂分子与蛋白质分子对接的构象是对接最稳定的一种构象，即结合能最低，EGCG-Cl分子的对接结合能分别为-7.3 kcal/mol，EGCG分子的对接结合能为-9.0 kcal/mol.

图8　(a)伏格列波糖分子的对接结果； (b)GCG分子的对接结果； (c)伏格列波糖分子(球状)结构平面图；(d)GCG分子(球状)结构平面图

图9　(a)EGCG-Cl分子的对接结果(晶蓝色)和EGCG分子的对接结果(灰白色)的重叠结构； (b)EGCG-Cl分子(球状)结构平面图

在图中可以看到，设计的EGCG-Cl分子与EGCG分子空间位置大体上是相近的，都能进入活性口袋与活性位点结合.EGCG-Cl分子与残基Q288、D405和D472形成静电作用；与残基Y508形成疏水作用；与残基H537形成了氢键.键长为2.85 Å，键长较短，结构较稳定.由此可见，此活性位点的选择较为正确.

2.2.2EGCG-NH2分子的对接结果与分析

图10呈现的就是设计的EGCG-NH2分子(RES1，晶蓝色)与蛋白质分子5AED的对接结果和EGCG分子(RES1，灰白色)与蛋白质分子5AED的对接结果进行序列对比的结果.研究所选的分子与蛋白质对接的构象是对接最稳定的一种构象，即结合能最低，EGCG-NH2分子的对接结合能为-8.7 kcal/mol，EGCG分子的对接结合能为-9.0 kcal/mol..

图10 (a)EGCG-NH2分子的对接结果(晶蓝色)和EGCG分子的对接结果(灰白色)的重叠结；(b)EGCG-NH2分子(球状)结构平面图

在图10中可以看到，设计的EGCG-NH2分子和EGCG分子在空间结构和形状上具有很高的重叠率.EGCG-NH2分子与残基D472形成疏水作用；与残基Y508形成静电作用；与残基Q288形成氢键，键长为2.11 Å.EGCG分子与H537残基形成氢键，键长分别为2.85 Å，2.98 Å，3.00 Å，键长均较短，结构较稳定.由此可见，此活性位点的选择较为正确.

2.2.3EGCG-Cl分子和EGCG-NH2分子对接结果的对比分析

图11呈现的就是设计的EGCG-Cl分子(RES1，晶蓝色)与蛋白质分子5AED的对接结果(灰白色)和EGCG-NH2分子(RES1，灰白色)与蛋白质分子5AED的对接结果(晶蓝色)的对比结果.这两种用于对比的构象是分别选取对接最稳定的一种构象，即结合能最低，EGCG-Cl分子对接的结合能为-8.1 kcal/mol，EGCG-NH2分子对接的结合能为-8.9 kcal/mol.

图11　EGCG-Cl分子的对接结果结构(晶蓝色)和EGCG-NH3分子的对接结果(灰白色)的重叠结构

在图11中可以看到，设计的EGCG-Cl和EGCG-NH2分子跟抑制剂分子EGCG一样，都能很好的进入活性口袋与活性位点结合，但这两个分子的位置没有完全重叠在一起，稍有偏差.EGCG-Cl分子对接的结果和EGCG分子与蛋白质分子5AED的对接结果基本相同.EGCG-Cl分子对接结果上连接Cl原子的羟基和EGCG分子对接结果上的羟基结合位置一样.EGCG-NH2分子与残基Q288和H537形成了氢键.残基Q288与EGCG-NH2分子中的氨基形成氢键的键长为2.22 Å；残基H537与EGCG-NH2分子形成氢键的键长为2.99 Å和3.00 Å.EGCG-NH2分子自身的羟基也与氨基形成了氢键，键长为2.34 Å.因此包含氨基的苯环与之前的相比，进行了一个180度的扭转，所以对比的位置产生了一定的偏差.

3　结论

本文主要采用分子对接的方法，研究了几种α-葡萄糖苷酶抑制剂与α-葡萄糖苷酶的结合模式和作用机制，明确了可能的结合位点.本文基于蛋白质分子5AED的晶体结构，找到其活性位点残基为Q288、D405、D472、Y508和H537.阿卡波糖和米格列醇羟基上的氢与活性位点残基形成多个氢键，具有较强的相互作用；伏格列波糖、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)和设计的两种分子都能很好的进入活性口袋，可以得出抑制剂分子所处的疏水环境和静电作用对抑制剂的结合有稳定作用.在最后通过相关的实验模拟验证，认为用上述介绍的分子优化对接方法来进行相关实验是具有可行性的，为实验上α-葡萄糖苷酶抑制剂的研究提供了理论基础.

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[责任编辑：周峰岩]

Mechanism Study of Alpha Glycosidase Inhibitors and Glycosidase

WANG wena，WANG Jin-hua，ZHANG Xiao-kanga, ZHAO Xiang-yub

(a.School of Chemical Engineering and Material Science;b.School of Art and Design,Zaozhuang University, Zaozhuang 277160,China)

Alpha glycosidase is a key enzyme that hydrolyzes carbohydrates, and the inhibition of the alpha glycosidase activity can suppress postprandial hyperglycemia. Inhibitors of alpha glycosidasecan defer absorption of carbohydrate in intestine, which are mature drugs in the treatment of diabetes. In order to discover new alpha glycosidase inhibitor with better therapeutic effects, it is very important to study the interaction between alpha glycosidase inhibitor and alpha glycosidase. Here, the method of molecular docking is adopted to investigate the binding modes and interaction mechanisms. Besides, two potential alpha glycosidase inhibitors are designed based on the docking results, which might provide theoretical information for the drug design on the experiment.

diabetes; glucosidase; inhibitor; molecular docking; active sites

2016-07-05

山东省高等学校科技发展计划项目(项目编号：J13LD04).

王文(1978-)，男，山东枣庄人，枣庄学院化学化工与材料科学学院副教授,理学硕士，主要从事生物小分子与酶体系作用机制研究.

G633.8

A

1004-7077(2016)05-0127-08