一种组氨酸修饰的芘类Hg2+荧光探针

唐　健, 沈靖文, 贾树岩, 陈　志, 李煦田, 马立军*

(1.华南师范大学化学与环境学院，广州 510006；2.吉林石化公司炼油厂，吉林 132022)



一种组氨酸修饰的芘类Hg2+荧光探针

唐健1, 沈靖文1, 贾树岩2, 陈志1, 李煦田1, 马立军1*

(1.华南师范大学化学与环境学院，广州 510006；2.吉林石化公司炼油厂，吉林 132022)

以组氨酸和芘甲酸为原料，设计合成了一种荧光化合物——芘甲酰组氨酸甲酯，通过核磁、质谱表征其结构. 荧光测试结果表明，在水溶液中该化合物能够对Hg2+表现出荧光猝灭响应，而相同条件下其他金属离子对该化合物几乎没有类似的荧光识别现象，因此该荧光化合物对Hg2+具有专一荧光识别作用，是一种有效的Hg2+荧光探针.

Hg2+； 组氨酸； 芘； 荧光探针

汞是一种污染极大的金属，由于其特殊的物理和化学性质，在水环境中的危害性尤其严重[1]. 20世纪初在日本发生的水俣病事件更是给人们敲响了警钟，让人们深刻地认识到汞对环境和人体健康所带来的破坏性和治理汞污染的迫切需要[2-3]. 自然界中的汞主要以无机汞和有机汞的形式存在，在水生环境中无机汞可以通过微生物等生物作用转化为危害性更大的有机汞[4]. 经过食物链的富集后，人体最终吸收较大浓度的汞，进而对血液系统、中枢神经系统及骨骼系统等造成严重的损伤，甚至致死[5-7]. 因此，在生命和水环境等诸领域中对汞的检测就显得尤为重要和迫切. 汞的检测方法有冷原子吸收光谱法、分光光度法、电化学法以及荧光探针法等[8]. 然而，与传统方法相比，荧光探针法具有操作简便、对仪器设备要求不高、可进行实时原位检测的优点，并且其高灵敏度[9]、高选择性受到广泛关注. 由于汞广泛存在于环境水体系中，因此设计高效灵敏的Hg2+的荧光探针显得十分重要. 本文将水溶性好的组氨酸和芘结合起来，合成了一种新型的水溶性荧光探针——芘甲酰组氨酸甲酯(简称PHE)，该探针能在水溶液中对Hg2+表现出高效专一的荧光识别作用.

1　实验部分

1.1实验仪器和试剂

仪器：荧光分光光度计(F-2500 Fluorescence Spectrophotometer)，采用的激发波长均为340 nm；紫外-可见分光光谱仪(SHIMADZU UV-1700 UV-vis spectrometer)；核磁共振波谱仪(Varian NMR Systems 400 MHz spectrometer)；液相色谱-质谱联用仪(LCQ Deca XP MAX).

试剂：芘甲酸、组氨酸、二甲基亚砜、二氯亚砜、无水甲醇、无水乙酸乙酯、无水乙醚、二氯甲烷、氘代DMSO、三乙胺、层析硅胶、HgCl2、Cu(NO3)2、PbCl2、无水Mg(SO4)、去离子水等. 所用试剂均为分析纯，且未经任何纯化. 去离子水自制. 除芘甲酸购自百灵威试剂有限公司外，其余常用试剂购自天津大茂.1.2探针的合成与表征

芘甲酰组氨酸甲酯(PHE)的合成路线如图1所示.

图1　芘甲酰组氨酸甲酯的合成反应

首先将组氨酸的羧基通过酯化反应制备成甲酯，然后其氨基与芘甲酰氯反应生成肽键，即得PHE.

(1)组氨酸甲酯盐酸盐的合成： 组氨酸甲酯盐酸盐的合成参照文献[10]，合成完毕后应立即进行下一步反应；

(2)芘甲酰氯的合成：将芘甲酸溶于二氯甲烷中，加入二氯亚砜，40 ℃加热搅拌回流7 h. 反应完全后，减压蒸去溶剂，得到芘甲酰氯；

(3)芘甲酰组氨酸甲酯(PHE)的合成：在圆底烧瓶中用20 mL二氯甲烷溶解0.18 g(0.74 mmol)组氨酸甲酯盐酸盐，并滴加0.5 mL三乙胺. 将溶解在10 mL二氯甲烷的0.16 g(0.65 mmol)芘甲酰氯缓慢滴加到上述组氨酸甲酯盐酸盐溶液中，在室温下充分反应，采用薄层色谱 (TLC)监测反应进程. 反应结束，抽滤并除去溶剂得到粗产物，用二氯甲烷溶解粗产物，水洗涤至水层呈中性，除去三乙胺，有机层用无水Mg(SO4)干燥，过滤，蒸干滤液，再将此粗产物用乙酸乙酯和甲醇作展开剂进行硅胶柱层析分离提纯，得到黄褐色的固体——芘甲酰组氨酸甲酯. 产物的1H NMR谱(图2A，400 MHz，DMSO-d6)中化学位移(ppm)和对应的质子类型归属为：11.95 (s, 1H, -NH-), 9.11 (d, 1H, -CONH-), 8.40～8.01 (m, 9H, pyrene(H)), 7.62 (s, 1H, imidazole(H)), 6.94 (s, 1H, imidazole(H)), 4.90 (m, 1H, -CH), 3.75 (s, 3H, -CH3), 3.11 (m, 2H, -CH2-). 电喷雾电离质谱(ESI-MS)测试(采用甲醇做溶剂)分析可知，分子式C24H19N3O3，理论计算的相对分子质量为397.14，实验测得的结果为398.22(图2B).

图2　芘甲酰组氨酸甲酯的1H NMR谱和质谱图

1.3溶液的配制

将PHE溶于DMSO中，配制成浓度为5.0 mmol/L的储备溶液，取储备溶液配制浓度为20.0 μmol/L含1%(体积分数，全文同)DMSO的水溶液. 分别配制浓度为5.0 mmol/L的HgCl2、Cu(NO3)2、PbCl2等水溶液.

2　结果讨论

2.1探针PHE对Hg2+的荧光识别

以340 nm作为激发波长时，含1% DMSO的20.0 μmol/L PHE水溶液在410 nm处有1个强的荧光发射峰(图3)，这是芘基团的特征发射峰[11]3424. 向此PHE水溶液中滴加不同浓度的Hg2+，可以观察到410 nm处的荧光发射峰强度随着Hg2+浓度的增加而逐渐减小，表明PHE与Hg2+发生了结合. 从PHE的分子结构式和结合文献[11-12]推断，组氨酸上的咪唑环具有孤对电子的含氮基团，这些基团提供与金属离子相结合的位点，当加入Hg2+后，可能由于咪唑环上的叔胺与酯键上羰基的氧原子发生配位作用，改变了环上的电子密度，从而阻断了PHE分子内的电荷转移，导致荧光强度发生猝灭作用. 加入Hg2+离子浓度到100.0 μmol/L时，PHE的荧光强度猝灭最大，达到70.0%，表明PHE可以在水溶液中对Hg2+产生荧光识别作用[13].

图3　20.0 μmol/L PHE溶液中不同Hg2+浓度的荧光光谱

Figure 3Fluorescent spectra of 20.0 μmol/L PHE upon addition of various amounts of Hg2+

在相同条件下，测得了PHE水溶液中包含浓度为30.0、60.0、100.0 μmol/L的Ag+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Ca2+、Mn2+、Ni2+、Zn2+等15种常见金属离子在410 nm处的荧光强度情况(图4). 以荧光的相对变化量(I-I0)/I0作为参考指标，随着金属离子浓度的增加，只有Hg2+的加入能够使PHE的荧光强度发生显著的变化，除了Ag+、Cu2+、Fe3+在高浓度下有微弱的荧光猝灭外，而其他金属离子则没有明显变化. 与文献[14]报道的探针相比，对Hg2+的选择性更好，进一步说明探针PHE对Hg2+具有高选择性荧光识别.

图4不同浓度金属离子的加入引起PHE荧光强度变化

Figure 4Changes of the fluorescent intensity of PHE after the addition of various amounts of metal ions

2.2PHE与Hg2+相互作用的结合比和结合常数

结构类似的探针与金属离子的结合比多数情况为1∶1[15]251，本文假设PHE与Hg2+的结合比为1∶1，二者的结合常数可由Hildebrand-Benesi方程拟合得到[10,16]. 通过I0/(I-I0)对c(Hg2+)-1作图，利用该方程能够线性拟合得到PHE与Hg2+的结合常数(图5)，拟合相关系数R2达到0.998，说明PHE以1∶1结合的假设是正确的. 同时拟合得到的结合常数Kobs为3.656×104L/mol，说明PHE与Hg2+之间的相互作用力较强，和文献[15]252报道的Hg2+荧光探针的结合常数在同一数量级上.

图5　PHE与Hg2+的结合常数评估

为了进一步确定PHE与Hg2+的结合模式，进行滴定实验绘制工作曲线Job图(Job’s plot)：固定PHE与Hg2+的总浓度为20.0 μmol/L，通过改变PHE与Hg2+的浓度并测出其相应的荧光强度，得出410 nm处的荧光强度差值(加入Hg2+前后)，然后对Hg2+占总浓度的比例(c(Hg2+)/20.0 μmol/L)作图，即得Job图(图6)，最高值对应于PHE与Hg2+形成稳定螯合物时Hg2+占总浓度的比例. 当Hg2+占总浓度的50%时，荧光强度差值达到最大，从而确定PHE与Hg2+的最佳结合比为1∶1，证实了上述假设.

图6总浓度为20.0 μmol/L的PHE和Hg2+溶液在410 nm的荧光强度差值随Hg2+所占浓度比的变化

Figure 6Fluorescence intensity changes of peak at 410 nm of PHE and Hg2+with a total concentration of 20.0 μmol/L

2.3PHE与Hg2+相互作用的紫外吸收光谱

PHE水溶液的紫外吸收光谱在275～285 nm和335～350 nm处有2个吸收峰(图7)，它们是芘基团的特征吸收峰. 随着加入Hg2+的浓度逐渐增大，2个吸收峰的强度均显著下降，说明PHE与Hg2+发生了螯合作用，从而影响到芘基团的光吸收性质.

2.4pH对PHE水溶液识别Hg2+的影响

在室温(295 K)下，测得PHE原溶液的pH为6.64，用NaOH和HCl调节PHE溶液体系的pH分别为4.23、4.75、5.78、6.19、6.64、7.48，检测不同酸性条件下PHE对Hg2+的荧光识别响应，Hg2+的浓度固定为30.0 μmol/L，将PHE的最大吸收峰显示的强度变化量(I-I0)/I0与溶液pH作图(图8). 可以明显看到，在pH 5.0～7.0接近生理环境的范围内，PHE对Hg2+的响应程度良好且变化不大，仅在pH<5.0时才对响应程度有所影响. 所以PHE在接近生理环境条件下(pH 5.0～7.0时)对Hg2+的识别和检测具有很好的应用前景[17].

图720.0 μmol/L PHE溶液中加入不同Hg2+浓度的紫外-可见吸收光谱

Figure 7UV-vis spectra of 20.0 μmol/L PHE upon addition of various amounts of Hg2+

图8不同pH的PHE(20.0 μmol/L)溶液中加入Hg2+(30.0 μmol/L)时最大荧光峰强度(I-I0)/I0的变化

Figure 8pH-dependence of the fluorescence response for the solution of PHE (20.0 μmol/L) and Hg2+(30.0 μmol/L)

3　结论

利用水溶性良好的组氨酸为识别基团、以芘为荧光信号基团，合成了水溶性好的荧光探针——芘甲酰组氨酸甲酯(PHE)，并通过核磁、质谱表征了它的结构. 实验结果表明，PHE在水溶液中能对Hg2+有高效专一的识别响应，PHE与Hg2+发生1∶1结合，它们之间形成1种较强的相互作用力，并且在接近中性条件下有最佳的识别响应，为水环境中Hg2+的检测提供一种有潜力的有效途径.

[1]冯新斌, 仇广乐, 付学吾,等. 环境汞污染[J]. 化学进展, 2009(Z1):436-457.

FENG X B, QIU G L, FU X W, et al. Mercury pollution in the environment[J]. Progress in Chemistry, 2009(Z1):436-457.

[2]MENG Q, HE C, SU W, et al. A new rhodamine-chitosan fluorescent material for the selective detection of Hg2+in living cells and efficient adsorption of Hg2+in natural water[J]. Sensors & Actuators B Chemical, 2012, 174(11):312-317.

[3]陈博.水俣公约[J]. 世界环境, 2015(1):7.

[4]VALBONA C, LEAN D R S, SCOTT S L. Abiotic methylation of mercury in the aquatic environment[J]. Science of the Total Environment, 2006, 368: 126-137.

[5]BOENING D W. Ecological effects, transport, and fate of mercury: a general review[J]. Chemosphere, 2000, 40(12):1335-1351.

[6]HARRIS H H, PICKERING I J, GEORGE G N. The chemical form of mercury in fish[J]. Science, 2003, 301(5637):1203-1203.

[7]KAUR P, ASCHNER M, SYVERSEN T. Glutathione modulation influences methyl mercury induced neurotoxicity in primary cell cultures of neurons and astrocytes[J]. Neurotoxicology, 2006, 27(4):492-500.

[8]MA L J, LI Y, LI L, et al. A protein-supported fluorescent reagent for the highly-sensitive and selective detection of mercury ions in aqueous solution and live cells[J]. Chemical Communications, 2008, 47(47):6345-6347.

[9]LI H W, LI Y, DANG Y Q, et al. An easily prepared hypersensitive water-soluble fluorescent probe for mercury(II) ions[J]. Chemical Communications, 2009, 29(29):4453-4455.

[10]马立军．基于氨基酸的重金属离子荧光探针的设计、合成、及识别机理[D]. 长春：吉林大学，2008：29.

MA L J. Design, synthesis and mechanism discrimination of amino acids-based fluorometric sensors for heavy metal ions[D]. Changchun: Jilin University,2008：29.

[11]YANG Y, GOU X, BLECHA J, et al. A highly selective pyrene based fluorescent sensor toward Hg2+detection[J]. Tetrahedron Letters, 2010, 51(26):3422-3425.

[12]CHENG H R, QIAN Y. Intramolecular fluorescence resonance energy transfer in a novel PDI-BODIPY dendritic structure: synthesis, Hg2+sensor and living cell imaging[J]. Sensors & Actuators B: Chemical, 2015,219:57-64.

[13]马立军,陈丽平,刘家熔,等. 谷氨酸修饰的Hg2+荧光探针的合成及性能研究[J]. 华南师范大学学报(自然科学版),2010 (2):69.

MA L J, CHEN L P, LIU J R, et al.The synthesis and mechanism study of glutamic acid-based fluorescent probes for mercury ion[J].Journal of South China Normal University(Natural Science Edition), 2010 (2):69.

[14]邓乐芳,张敏,严玉华,等. 丹酰基团修饰的喹啉衍生物作为Cu2+和Hg2+荧光探针研究[J]. 华南师范大学学报(自然科学版), 2013,45 (5):76.

DENG L F, ZHANG M, YAN Y H, et al.Fluorescence probe for copper(II) and mercury(II) based on the dansyl aminoquinoline[J]. Journal of South China Normal University(Natural science Edition), 2013,45 (5):76.

[15]KUMAR A, KIM H S. N-(3-Imidazolyl)propyl dansylamide as a selective Hg2+sensor in aqueous media through electron transfer[J]. Spectrochimica Acta Part A Molecular & Biomolecular Spectroscopy, 2015,145(1):250-254.

[16]BENESI H A, HILDEBRAND J H. A spectrophotometric investigation of the interaction of iodine with aromatic hydrocarbons[J]. Journal of the American Chemical Society, 1949,71:2703-2707.

[17]ZHAO Y, SUN Y, Lü X, et al. Rhodamine-based chemosensor for Hg2+in aqueous solution with a broad pH range and its application in live cell imaging[J]. Organic & Biomolecular Chemistry, 2010, 8(18):4143-4147.

【中文责编：成文英文责编：李海航】

A Fluorescent Probe Based on Histidine Modified Pyrene for Hg2+

TANG Jian1, SHEN Jingwen1, JIA Shuyan2, CHEN Zhi1, LI Xutian1, MA Lijun1*

(1.School of Chemistry and Environment,South China Normal University,Guangzhou 510006,China;2.Jilin Petrochemistry company Refinery,Jilin 132022,China)

A new Hg2+fluorescent probe, 1-pyrenecarboxalacyl-histidine-ester(PHE), was synthesized. The experiment results indicated that the probe showed a specific recognition for Hg2+with a fluorescent quenching signal in aqueous solution. No obvious fluorescent changes were observed for PHE in the presence of other heavy metal ions in the same condition. Therefore, PHE showed a selective recognition for Hg2+.

Hg2+; histidine; pyrene; fluorescent probe

2015-07-17《华南师范大学学报(自然科学版)》网址：http://journal.scnu.edu.cn/n

广东省自然科学基金项目(2015A030313392);广州市珠江科技新星资助项目(2012J2200026)

马立军,副教授, Email: mlj898021@scnu.edu.cn.

O621.3

A

1000-5463(2016)04-0040-05